| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-13页 |
| 前言 | 第13-26页 |
| 1 新孢子虫病概述 | 第13-16页 |
| ·病原体 | 第13页 |
| ·分类地位 | 第13页 |
| ·形态结构 | 第13-14页 |
| ·生活史 | 第14-15页 |
| ·分布情况 | 第15页 |
| ·传播途径 | 第15页 |
| ·牛新孢子虫病主要症状 | 第15-16页 |
| 2 诊断方法 | 第16-18页 |
| ·免疫学诊断 | 第16-17页 |
| ·免疫组织化学染色(IHC) | 第16页 |
| ·凝集试验(AT) | 第16-17页 |
| ·间接荧光抗体试验(IFAT) | 第17页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第17页 |
| ·免疫色谱法(ICT) | 第17页 |
| ·分子生物学诊断 | 第17-18页 |
| ·间接原位PCR(Indirectly insitu PCR) | 第18页 |
| ·Nested PCR | 第18页 |
| ·Alternative PCR | 第18页 |
| ·环介导等温扩增技术(LAMP) | 第18页 |
| 3 免疫机制 | 第18-19页 |
| 4 真核表达载体pVAX1 | 第19页 |
| 5 外源基因导入细胞的方法 | 第19-20页 |
| 6 疫苗的分类 | 第20-24页 |
| ·活疫苗 | 第20-21页 |
| ·死疫苗 | 第21页 |
| ·基因工程疫苗 | 第21-24页 |
| 7 本研究的目的及意义 | 第24-26页 |
| 材料与方法 | 第26-39页 |
| 1 材料 | 第26-30页 |
| ·新孢子虫体外培养所用材料 | 第26页 |
| ·血清 | 第26页 |
| ·试验动物 | 第26页 |
| ·免疫佐剂 | 第26页 |
| ·菌株、质粒、细胞 | 第26页 |
| ·酶与试剂 | 第26-27页 |
| ·各种溶液及培养基 | 第27-28页 |
| ·间接荧光抗体试验所需材料 | 第28-29页 |
| ·沙鼠脾细胞悬液制备所需材料 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| 2 试验方法 | 第30-39页 |
| ·牛新孢子虫PO基因真核表达质粒的构建及瞬时表达 | 第30-36页 |
| ·引物的设计与合成 | 第31页 |
| ·牛新孢子虫基因组DNA的提取 | 第31页 |
| ·牛新孢子虫PO基因的PCR扩增 | 第31页 |
| ·PCR产物的纯化回收 | 第31-32页 |
| ·PO重组基因与pMD 18-T Simple克隆载体的连接 | 第32页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·重组质粒的转化 | 第32-33页 |
| ·转化菌落的鉴定 | 第33-34页 |
| ·核苷酸序列序列测定及分析 | 第34页 |
| ·真核表达质粒的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| ·重组体转染细胞 | 第35页 |
| ·RT-PCR检测重组质粒的表达 | 第35-36页 |
| ·间接免疫荧光 | 第36页 |
| ·DNA疫苗的制备 | 第36-38页 |
| ·不同佐剂DNA疫苗的制备 | 第36-37页 |
| ·疫苗免疫效果试验 | 第37-38页 |
| ·沙鼠攻毒试验 | 第38页 |
| ·应用组织PCR法检测沙鼠新孢子虫人工感染 | 第38页 |
| ·数据统计 | 第38-39页 |
| 结果 | 第39-48页 |
| 1 新孢子虫PO基因PCR扩增结果 | 第39页 |
| 2 pMD18-T-PO重组质粒的鉴定 | 第39-40页 |
| 3 重组克隆质粒的序列分析 | 第40-41页 |
| 4 重组质粒pVAX1-NcPO鉴定结果 | 第41-42页 |
| 5 RT-PCR检测重组质粒在Vero细胞中表达 | 第42页 |
| 6 间接免疫荧光检测pVAX1-NcPO在细胞中的瞬时表达 | 第42-43页 |
| 7 间接荧光抗体试验结果 | 第43-44页 |
| 8 免疫沙鼠血清特异性抗体的动态变化 | 第44-45页 |
| 9 沙鼠T淋巴细胞亚群含量的测定结果 | 第45-47页 |
| 10 疫苗保护率测定结果 | 第47页 |
| 11 PCR检测结果 | 第47-48页 |
| 讨论 | 第48-54页 |
| 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 作者简介 | 第62页 |
