| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-24页 |
| 1.1 植物病害生物防治 | 第13-17页 |
| 1.1.1 植物病害生物防治机理 | 第13-14页 |
| 1.1.2 芽孢杆菌的生物防治 | 第14-17页 |
| 1.2 生防芽孢杆菌的全基因组测序技术 | 第17-18页 |
| 1.3 细菌生物膜 | 第18-20页 |
| 1.4 细菌运动性和定殖特征 | 第20-22页 |
| 1.5 荧光蛋白标记技术 | 第22页 |
| 1.6 基因敲除技术 | 第22-23页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-43页 |
| 2.1 材料 | 第24-27页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第24-25页 |
| 2.1.2 溶液配制 | 第25页 |
| 2.1.3 培养基配制 | 第25页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第25-26页 |
| 2.1.5 生化及分子生物学试剂 | 第26页 |
| 2.1.6 引物设计与合成 | 第26-27页 |
| 2.2 方法 | 第27-43页 |
| 2.2.1 解淀粉芽孢杆菌PEBA20全基因组基本信息 | 第27-29页 |
| 2.2.1.1 解淀粉芽孢杆菌PEBA20全基因组DNA提取 | 第27-28页 |
| 2.2.1.2 基因组测序、注释及功能预测 | 第28页 |
| 2.2.1.3 PEBA20菌株gyrA、cheA基因蛋白序列进化分析 | 第28页 |
| 2.2.1.4 解淀粉芽孢杆菌PEBA20的RSP、NRPS和PKS基因簇分析 | 第28-29页 |
| 2.2.2 变异株SCEV的重测序及分析 | 第29-30页 |
| 2.2.3 解淀粉芽孢杆菌PEBA20sfp基因突变株的构建及相关特性研究 | 第30-38页 |
| 2.2.3.1 sfp基因突变株构建方法设计 | 第30-31页 |
| 2.2.3.2 PEBA20基因组DNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.3.4 sfpF与sfpB的单酶切 | 第32-33页 |
| 2.2.3.5 sfpF、sfpB酶切产物的连接 | 第33页 |
| 2.2.3.6 sfpF-sfpB与pMD18-T载体的连接 | 第33页 |
| 2.2.3.7 E.coliDH5α感受态的制备(采用CaCl2法) | 第33页 |
| 2.2.3.8 sfpF-sfpB-pMD18-T转化E.coliDH5α及PCR验证 | 第33-34页 |
| 2.2.3.9 质粒sfpF-sfpB-pMD18-T和pMUTIN4提取 | 第34-35页 |
| 2.2.3.10 sfpF-sfpB-pMD18-T重组质粒与pMUTIN4质粒的双酶切及产物纯化回收 | 第35-36页 |
| 2.2.3.11 sfpF-sfpB-pMD18-T与自杀质粒pMUTIN4双酶切产物的连接 | 第36页 |
| 2.2.3.12 sfpF-sfpB-pMUTIN4连接产物转化DH5α及PCR验证 | 第36页 |
| 2.2.3.13 sfpF-sfpB-pMUTIN4质粒提取及PCR验证 | 第36页 |
| 2.2.3.14 PEBA20感受态细胞的制备 | 第36页 |
| 2.2.3.15 sfpF-sfpB-pMUTIN4质粒电转化PEBA20感受态细胞 | 第36-37页 |
| 2.2.3.16 二次重组突变体的筛选 | 第37页 |
| 2.2.3.17 sfp突变株接种培养液的制备 | 第37页 |
| 2.2.3.18 sfp突变株固气界面生物膜(Colony)表型测定 | 第37-38页 |
| 2.2.3.19 sfp突变株气液界面生物膜(Pellicle)表型测定 | 第38页 |
| 2.2.3.20 sfp基因对抗菌活性的影响 | 第38页 |
| 2.2.3.21 芽孢杆菌簇动性的测定 | 第38页 |
| 2.2.4 解淀粉芽孢杆菌PEBA20绿色荧光蛋白表达菌株构建 | 第38-43页 |
| 2.2.4.1 GFP表达菌株构建方法设计 | 第38-39页 |
| 2.2.4.2 枯草芽孢杆菌B3全基因组DNA提取 | 第39页 |
| 2.2.4.3 p43启动子和gfpmut3a基因的扩增 | 第39-40页 |
| 2.2.4.4 p43-gfpmut3a片段的重叠延伸扩增 | 第40-41页 |
| 2.2.4.5 卡那霉素抗性基因的扩增 | 第41页 |
| 2.2.4.6 amyE基因前后臂分别扩增 | 第41页 |
| 2.2.4.7 p43gfpmut3a、kan、amyEF、amyEB的连接克隆及菌落PCR检测 | 第41-42页 |
| 2.2.4.8 pEasy-Blunt-simple-p43gfp,pMD18-T-kan,pEasy-Blunt-simple-amyEF,pEasy-Blunt-simple-amyEB质粒提取及电泳检测 | 第42页 |
| 2.2.4.9 质粒pEasy-Blunt-simple-p43gfp,pMD18-T-kan,pEasy-Blunt-simple-amyEF,pEasy-Blunt-simple-amyEB的酶切 | 第42页 |
| 2.2.4.10 酶切产物与pMUTIN4的连接克隆及菌落PCR检测 | 第42页 |
| 2.2.4.11 转化质粒p43GFPamy的DH5α荧光检测 | 第42页 |
| 2.2.4.12 质粒p43GFPamy的电转化PEBA20及后续筛选 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-70页 |
| 3.1 解淀粉芽孢杆菌PEBA20全基因组基本信息 | 第43-50页 |
| 3.1.1 解淀粉芽孢杆菌PEBA20全基因组提取 | 第43页 |
| 3.1.2 解淀粉芽孢杆菌PEBA20全基因组概况 | 第43-44页 |
| 3.1.3 解淀粉芽孢杆菌PEBA20基因组功能注释 | 第44-46页 |
| 3.1.4 解淀粉芽孢杆菌PEBA20进化分析 | 第46-48页 |
| 3.1.5 解淀粉芽孢杆菌PEBA20的RSP、NRPS和PKS基因簇分析 | 第48-50页 |
| 3.2 变异株SCEV的重测序及分析 | 第50-57页 |
| 3.2.1 SCEV重测序Reads与参考基因组FZB42差异分析 | 第50-55页 |
| 3.2.2 变异株SCEV与野生株PEBA20基因组差异比对分析 | 第55-57页 |
| 3.3 解淀粉芽孢杆菌PEBA20sfp基因突变株的构建及相关特性研究 | 第57-64页 |
| 3.3.1 同源前臂sfpF与同源后臂sfpB的PCR扩增 | 第57页 |
| 3.3.2 sfpF与sfpB的连接及连接产物的克隆 | 第57-58页 |
| 3.3.3 sfpF-sfpB-pMD18-T与pMUTIN4质粒的提取与双酶切 | 第58页 |
| 3.3.4 sfpF-sfpB与pMUTIN4酶切产物的连接及重组质粒的克隆 | 第58-59页 |
| 3.3.5 sfpF-sfpB-pMUTIN4电转化PEBA20感受态及抗生素筛选 | 第59-60页 |
| 3.3.6 sfp突变株固-气界面生物膜形成测定 | 第60-61页 |
| 3.3.7 sfp突变株液-气界面生物膜形成测定 | 第61-62页 |
| 3.3.8 sfp基因对抗菌活性的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.9 sfp基因对簇动性的影响 | 第63-64页 |
| 3.4 解淀粉芽孢杆菌PEBA20绿色荧光蛋白表达载体构建 | 第64-70页 |
| 3.4.1 p43启动子和gfpmut3a基因的扩增 | 第64-65页 |
| 3.4.2 p43gfpmut3a片段的重叠延伸扩增 | 第65页 |
| 3.4.3 卡那霉素抗性基因的扩增 | 第65-66页 |
| 3.4.4 amyE基因前后臂分别扩增 | 第66页 |
| 3.4.5 p43gfpmut3a、kan、amyEF、amyEB的连接克隆及菌落PCR检测 | 第66-67页 |
| 3.4.6 pEasy-Blunt-simple-p43gfp,pMD18-T-kan,pEasy-Blunt-simple-amyEF,pEasy-Blunt-simple-amyEB质粒提取及电泳检测 | 第67页 |
| 3.4.7 质粒pEasy-Blunt-simple-p43gfp,pMD18-T-kan,pEasy-Blunt-simple-amyEF,pEasy-Blunt-simple-amyEB的酶切 | 第67-68页 |
| 3.4.8 酶切产物与pMUTIN4的连接克隆及菌落PCR检测 | 第68-69页 |
| 3.4.9 转化质粒p43GFPamy的DH5α荧光检测 | 第69页 |
| 3.4.10 质粒p43GFPamy的电转化PEBA20及后续筛选 | 第69-70页 |
| 4 讨论 | 第70-73页 |
| 4.1 PEBA20全基因组测序特征 | 第70页 |
| 4.2 变异株SCEV与野生株PEBA20基因组差异比较 | 第70-71页 |
| 4.3 解淀粉芽孢杆菌PEBA20sfp基因突变株构建及相关特性研究 | 第71-72页 |
| 4.4 芽孢杆菌定殖特征及绿色荧光蛋白表达载体构建 | 第72-73页 |
| 5 结论 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第84页 |
