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海带(Saccharina japonica)褐藻胶合成途径若干基因的克隆、表达以及功能验证

摘要第5-7页
ABSTRACT第7-9页
第一章 文献综述第16-34页
    1. 褐藻生物学特征第16-20页
        1.1 海藻简介第16-17页
        1.2 海带简介第17页
        1.2.1 海带的分类地位、分布以及基本生物学特征第17-18页
        1.2.2 海带属生活史简介第18-19页
        1.2.3 海带的应用价值第19-20页
    2. 褐藻胶概况第20-23页
        2.1 褐藻胶的结构以及来源第20-21页
        2.2 褐藻胶生物活性以及应用研究概述第21-23页
            2.2.1 褐藻胶多糖的生物活性第21-22页
            2.2.2 褐藻胶低聚糖的生物活性第22-23页
    3. 褐藻胶的生物合成研究概述第23-33页
        3.1 褐藻胶的生物合成研究进展第23-25页
        3.2 藻类中褐藻胶生物合成通路研究进展第25-26页
        3.3 褐藻胶合成通路关键基因研究概况第26-33页
            3.3.1 磷酸甘露糖异构酶(PMI)研究概况第26-28页
            3.3.2 磷酸甘露糖变位酶(PMM)研究概况第28-29页
            3.3.3 GDP-甘露糖焦磷酸化酶(MPG)研究概况第29-30页
            3.3.4 GDP-甘露糖脱氢酶(GMD)研究概况第30-31页
            3.3.5 甘露糖醛酸 C5 差向异构酶基因(AlgG)研究概况第31-33页
    4. 藻类褐藻胶生物合成途径研究的目的和意义第33-34页
第二章 藻类褐藻胶生物合成基因分析第34-70页
    1. 生物信息学和系统进化分析方法第34-35页
        1.1 OneKP 转录组数据库和海带基因组数据库搜索第34页
        1.2 褐藻胶生物合成途径基因分析方法第34-35页
            1.2.1 生物信息学分析第34-35页
            1.2.2 多序列比对以及系统进化树的构建第35页
    2. 数据分析结果第35-63页
        2.1 褐藻胶合成通路基因转录组以及基因组搜索结果第35-36页
        2.2 PMI 和 MPG 基因分析结果第36-42页
            2.2.1 PMI 基因数据库注释结果第36-37页
            2.2.2 MPG 基因数据库注释结果第37页
            2.2.3 同源性分析和保守性结构域分析第37-39页
            2.2.4 三维结构预测第39-41页
            2.2.5 系统进化分析结果第41-42页
        2.3 PMM 基因分析结果第42-49页
            2.3.1 PMM 基因数据库注释结果第42-44页
            2.3.2 PMM 基因结构分析第44页
            2.3.3 PMM 基因同源性分析和和保守结构域预测第44-46页
            2.3.4 三维结构预测第46-47页
            2.3.5 PMM 基因系统进化分析结果第47-49页
        2.4 UGD/GMD 基因分析结果第49-54页
            2.4.1 UGD/GMD 基因数据库注释结果第49页
            2.4.2 褐藻内 UGD/GMD 基因分型和结构分析第49-51页
            2.4.3 同源性分析和保守结构域分析第51-52页
            2.4.4 三级结构分析第52-53页
            2.4.5 系统发生学分析第53-54页
        2.5 algG 基因分析结果第54-63页
            2.5.1 algG 基因搜索结果第54-55页
            2.5.2 algG 基因结构和基因排布分析第55-58页
            2.5.3 algG 基因同源性和结构域分析第58页
            2.5.4 三级结构分析第58-59页
            2.5.5 系统发生学分析结果第59-63页
    3. 讨论第63-70页
        3.1 藻类褐藻胶的生物合成第63-66页
            3.1.1 藻类褐藻胶前体物质 GDP-甘露糖醛酸(GDP-mannuronic acid)的合成第63-65页
            3.1.2 藻类褐藻胶合成通路后端基因第65-66页
        3.2 褐藻胶合成通路基因的多拷贝和串联重复现象第66-68页
        3.3 褐藻胶合成通路基因的分布以及其系统进化第68-70页
第三章 海带 Sja-PMM 基因和 Sja-algG 基因克隆、原核表达和真核表达第70-97页
    1. 实验材料第70-74页
        1.1 海带样品第70页
        1.2 试剂、试剂盒和主要仪器第70-71页
        1.3 菌株和质粒第71页
        1.4 主要试剂的配置方法第71-74页
    2. 实验方法第74-84页
        2.1 海带配子体 RNA 的提取和总 RNA 的反转录第74-75页
            2.1.1 海带配子体 RNA 的提取第74-75页
            2.1.2 海带 cDNA 第一链的合成第75页
        2.2 海带 SjPMM 和 algG 基因的 CDS 序列的扩增第75-76页
            2.2.1 海带 Sj-PMM 和 Sj-algG 基因特异性引物设计第75-76页
            2.2.2 特异性引物 TD-PCR 扩增第76页
        2.3 PCR 产物的回收和目的基因的克隆测序第76页
            2.3.1 PCR 产物回收第76页
            2.3.2 目的基因的克隆测序第76页
        2.4 原核表达第76-81页
            2.4.1 原核表达载体 pET32a-Sj-PMM、pET32a-Sj-algG 的构建第76-78页
            2.4.2 重组质粒 pET32a-Sj-PMM、pET32a-Sj-algG 转化至 BL21 表达载体第78页
            2.4.3 融合蛋白 His-Sja-PMM 和 His-Sja-AlgG 的诱导表达第78页
            2.4.4 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Weastern-blot 检测第78-80页
            2.4.5 重组蛋白 His- PMM、His- AlgG 的纯化和透析第80-81页
        2.5 真核表达第81-84页
            2.5.1 pPICZαA-algG 表达载体的构建第81-82页
            2.5.2 质粒的线性化和纯化第82页
            2.5.3 巴斯德毕赤酵母 X-33 感受态细胞的制备第82-83页
            2.5.4 将目的片段电击转化至巴斯德毕赤酵母 X-33第83页
            2.5.5 PCR 检测转化后重组子第83-84页
                2.5.5.1 PCR 模板制备第83-84页
                2.5.5.2 PCR 检测阳性克隆第84页
            2.5.6 毕赤酵母 X-33 中 pPICZαA-algG 的诱导和表达第84页
            2.5.7 Ni 柱纯化和透析第84页
    3. 实验结果及分析第84-95页
        3.1 真海带配子体 RNA 的提取结果第84-85页
        3.2 海带 Sj-PMM 基因和 Sj-algG 基因 CDS 扩增结果第85页
        3.3 海带 Sja-PMM 基因和 Sja-algG 基因全长的扩增第85-86页
        3.4 pET32a-Sja-PMM 和 pET32a-Sja-algG 表达载体的构建第86-87页
        3.5 pET32a-Sja-PMM 和 pET32a-Sja-algG 质粒转化至表达菌株 BL21第87-88页
        3.6 His-algG 融合蛋白诱导表达第88-92页
            3.6.1 pET32a-Sja-algG 不同诱导条件的筛选第88-90页
            3.6.2 pET32a-Sja-PMM 的诱导表达第90-91页
            3.6.3 Ni 柱纯化重组蛋白第91-92页
        3.7 原核表达 Western-Blot 检测结果第92页
        3.8 pPICZαA-Sja-algG 表达载体的构建第92-93页
        3.9 pPICZαA- Sj-algG 电转化至巴斯德毕赤酵母 X-3378第93-94页
        3.10 Sj-AlgG 蛋白在巴斯德毕赤酵母 X-33 诱导表达第94-95页
    4. 讨论第95-97页
第四章 海带 Sja-PMI4 蛋白和 PMM 蛋白的酶促反应动力学研究.82第97-118页
    1. 实验材料第97页
        1.1 蛋白样品第97页
        1.2 试剂和主要仪器第97页
        1.3 主要试剂的配置方法第97页
    2. 实验方法第97-101页
        2.1 Sja-PMI4 的活性检测第97-99页
            2.1.1 酶活力的测定第97-98页
            2.1.2 重组 Sja-PMI4 蛋白 MPG 酶活性第98-99页
        2.2 Sja-PMM 蛋白的活性检测第99-101页
            2.2.1 PMM 和 PGM 酶活性测定第99-100页
            2.2.2 重组 Sja-PMM 蛋白 PMM 和 PGM 酶活性第100-101页
        2.3 数据分析第101页
    3. 结果与分析第101-111页
        3.1 Sja-PMI4 酶学性质研究第101-105页
            3.1.1 反应时间对酶活性的影响第101-102页
            3.1.2 温度对酶活性的影响第102-103页
            3.1.3 酸碱度 pH 对酶活性的影响第103-104页
            3.1.4 金属离子对酶活性的影响第104页
            3.1.5 酶促反应动力学参数的计算第104-105页
        3.2 Sja-PMM 酶学性质研究第105-111页
            3.2.1 反应时间对酶活性的影响第105-106页
            3.2.2 温度对酶活性的影响第106-107页
            3.2.3 酸碱度 pH 对酶活性的影响第107-109页
            3.2.4 金属离子对酶活性的影响第109-110页
            3.2.5 酶促反应动力学参数的计算第110-111页
    4. 讨论第111-118页
        4.1 真海带 Sja-PMI4 蛋白的 MPG 酶活性检测第111-113页
            4.1.1 藻类中 PMI/MPG 双功能基因的发现第111-112页
            4.1.2 藻类中 Sja-PMI4 蛋白的酶学性质第112-113页
        4.2 真海带 Sja-PMM 蛋白酶活性检测第113-118页
            4.2.1 藻类中 PMM 蛋白的酶学研究现状第113-114页
            4.2.2 藻类中 Sja-PMM 蛋白的酶学性质第114-118页
参考文献第118-129页
附录第129-134页
致谢第134-135页
个人简历第135页
发表的学术论文第135-136页

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