| 中文摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第13-31页 |
| 1.1 D-氨基酰化酶 | 第13-24页 |
| 1.1.1 D-氨基酰化酶的发现 | 第13-14页 |
| 1.1.2 D-氨基酰化酶的来源 | 第14-16页 |
| 1.1.3 D-氨基酰化酶的性质 | 第16-18页 |
| 1.1.4 D-氨基酰化酶的应用 | 第18-22页 |
| 1.1.5 Alcaligenes 来源的 D-氨基酰化酶与 D-缬氨酸 | 第22-24页 |
| 1.2 E.coli 工程菌的构建 | 第24-28页 |
| 1.2.1 酶促与化学合成法制备外源基因 | 第24-27页 |
| 1.2.2 TIR 区二级结构对外源蛋白表达的影响 | 第27-28页 |
| 1.3 酶的固定化 | 第28-29页 |
| 1.3.1 酶的固定化 | 第28-29页 |
| 1.3.2 固定化酶的酶学性质 | 第29页 |
| 1.3.3 固定化酶的应用 | 第29页 |
| 1.4 本研究目的与意义 | 第29-31页 |
| 第二章 来源于 AlcaligenesA-6 D-氨基酰化酶基因的合成 | 第31-61页 |
| 2.1 材料与方法 | 第31-40页 |
| 2.1.1 试剂与材料 | 第31-32页 |
| 2.1.2 溶液配制 | 第32-33页 |
| 2.1.3 仪器与设备 | 第33页 |
| 2.1.4 D-氨基酰化酶基因的合成 | 第33-35页 |
| 2.1.5 测序亚克隆载体 pUC-dan 的构建 | 第35-40页 |
| 2.2 结果与讨论 | 第40-59页 |
| 2.2.1 来源于 Alcaligenes A-6 D-氨基酰化酶的氨基酸序列 | 第40页 |
| 2.2.2 E.coli 密码子频率表 | 第40页 |
| 2.2.3 E.coli 偏爱密码子编码的 D-氨基酰化酶 | 第40-41页 |
| 2.2.4 拟合成序列全长 | 第41-44页 |
| 2.2.5 寡核苷酸的拆分 | 第44-46页 |
| 2.2.6 D-aminoacylase 的两步法合成 | 第46-47页 |
| 2.2.7 D-aminoacylase 的三步法合成 | 第47-50页 |
| 2.2.8 测序载体 pUC-dan 的构建 | 第50页 |
| 2.2.9 测序结果 | 第50-56页 |
| 2.2.10 合成基因中碱基错误的修复 | 第56-59页 |
| 2.3 本章小结 | 第59-61页 |
| 第三章 D-aminoazylase 基因工程菌的构建与表达 | 第61-83页 |
| 3.1 材料与方法 | 第61-67页 |
| 3.1.1 试剂与材料 | 第61页 |
| 3.1.2 溶液配制 | 第61-62页 |
| 3.1.3 融合表达载体 pET-trx-dan 的构建 | 第62-64页 |
| 3.1.4 非融合表达载体 pET-dan 的构建 | 第64页 |
| 3.1.5 D-aminoazylase 的诱导表达 | 第64-65页 |
| 3.1.6 表达蛋白可溶性分析 | 第65页 |
| 3.1.7 D-aminoazylase 的酶活力测定 | 第65-66页 |
| 3.1.8 Western-blot 检测 | 第66-67页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第67-80页 |
| 3.2.1 融合表达载体 pET-trx-dan 的构建 | 第67-69页 |
| 3.2.2 非融合表达载体 pET-dan 的构建 | 第69-70页 |
| 3.2.3 表达载体测序结果 | 第70-75页 |
| 3.2.4 D-aminoazylase 的诱导表达 | 第75-78页 |
| 3.2.5 D-aminoazylase 的可溶性分析 | 第78页 |
| 3.2.6 D-aminoazylase 的发酵活力测定 | 第78-79页 |
| 3.2.7 D-aminoazylase 的 Western-Blot 分析 | 第79-80页 |
| 3.3 本章小结 | 第80-83页 |
| 第四章 TIR 区密码子选择对 D-aminoazylase 表达的影响 | 第83-97页 |
| 4.1 材料与方法 | 第83-84页 |
| 4.1.1 试剂与材料 | 第83页 |
| 4.1.2 密码子的替换 | 第83页 |
| 4.1.3 mRNA 翻译起始区二级结构的预测 | 第83页 |
| 4.1.4 点突变 | 第83页 |
| 4.1.5 SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达 | 第83-84页 |
| 4.1.6 D-aminoazylase 的发酵活力测定 | 第84页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第84-94页 |
| 4.2.1 同义密码子的选择 | 第84页 |
| 4.2.2 同义密码子编码的 SGSA 序列 | 第84-88页 |
| 4.2.3 TIR 区 mRNA 二级结构 | 第88-90页 |
| 4.2.4 TIR 区密码子选择对 D-aminoazylase 表达的影响 | 第90-94页 |
| 4.3 本章小结 | 第94-97页 |
| 第五章 D-aminoazylase 发酵工艺研究 | 第97-107页 |
| 5.1 材料与方法 | 第97-98页 |
| 5.1.1 试剂与仪器 | 第97页 |
| 5.1.2 D-aminoazylase 活性测定 | 第97页 |
| 5.1.3 蛋白胨浓度对 D-ANase 表达的影响 | 第97页 |
| 5.1.4 酵母浸粉浓度对 D-ANase 表达的影响 | 第97页 |
| 5.1.5 葡萄糖浓度对 D-ANase 表达的影响 | 第97页 |
| 5.1.6 培养基初始 pH 对 D-ANase 表达的影响 | 第97-98页 |
| 5.1.7 培养温度对 D-ANase 表达的影响 | 第98页 |
| 5.1.8 IPTG 浓度对 D-ANase 表达的影响 | 第98页 |
| 5.1.9 诱导时机对 D-ANase 表达的影响 | 第98页 |
| 5.1.10 诱导时间对 D-ANase 表达的影响 | 第98页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第98-104页 |
| 5.2.1 蛋白胨浓度对 D-ANase 表达的影响 | 第98-99页 |
| 5.2.2 酵母浸粉浓度对 D-ANase 表达的影响 | 第99-100页 |
| 5.2.3 葡萄糖浓度对 D-ANase 表达的影响 | 第100页 |
| 5.2.4 培养基初始 pH 对 D-ANase 表达的影响 | 第100-101页 |
| 5.2.5 培养温度对 D-ANase 表达量的影响 | 第101-102页 |
| 5.2.6 IPTG 浓度对 D-ANase 表达量的影响 | 第102页 |
| 5.2.7 诱导时机对 D-ANase 表达的影响 | 第102-103页 |
| 5.2.8 诱导时间对 D-ANase 表达量的影响 | 第103-104页 |
| 5.2.9 最适发酵工艺条件下的 D-ANase 表达 | 第104页 |
| 5.3 本章小结 | 第104-107页 |
| 第六章 D-aminoazylase 纯化工艺研究 | 第107-117页 |
| 6.1 材料与方法 | 第107-110页 |
| 6.1.1 试剂与仪器 | 第107-108页 |
| 6.1.2 蛋白质含量标准曲线 | 第108页 |
| 6.1.3 D-ANase 酶活测定 | 第108页 |
| 6.1.4 菌体破碎工艺探索 | 第108-109页 |
| 6.1.5 D-aminoazylase 纯化工艺探索 | 第109-110页 |
| 6.1.6 D-ANase 蛋白纯度和分子量鉴定 | 第110页 |
| 6.2 结果与讨论 | 第110-115页 |
| 6.2.1 蛋白质含量标准曲线 | 第110-111页 |
| 6.2.2 菌体破碎工艺探索 | 第111-113页 |
| 6.2.3 融合表达 D-ANase 蛋白纯化结果 | 第113-114页 |
| 6.2.4 非融合表达 D-aminoazylase 层析纯化工艺 | 第114-115页 |
| 6.3 本章小结 | 第115-117页 |
| 第七章 D-aminoazylase 酶学性质研究 | 第117-127页 |
| 7.1 材料与方法 | 第117-119页 |
| 7.1.1 试剂与材料 | 第117页 |
| 7.1.2 仪器与设备 | 第117-118页 |
| 7.1.3 D-ANase 底物特异性检测 | 第118页 |
| 7.1.4 pH 值对酶活性的影响 | 第118页 |
| 7.1.5 温度对酶活性的影响 | 第118页 |
| 7.1.6 金属离子对酶活性的影响 | 第118页 |
| 7.1.7 底物浓度对酶促反应的影响 | 第118-119页 |
| 7.1.8 D-ANase 热稳定性分析 | 第119页 |
| 7.1.9 D-ANase pH 稳定性分析 | 第119页 |
| 7.2 结果与讨论 | 第119-126页 |
| 7.2.1 D-ANase 催化底物特异性 | 第119页 |
| 7.2.2 pH 值对酶活性的影响 | 第119-121页 |
| 7.2.3 温度对酶活性的影响 | 第121页 |
| 7.2.4 金属离子对酶活性的影响 | 第121-122页 |
| 7.2.5 底物浓度对酶活性的影响 | 第122-124页 |
| 7.2.6 D-ANase 热稳定性分析 | 第124-125页 |
| 7.2.7 D-ANase pH 稳定性分析 | 第125-126页 |
| 7.3 本章小结 | 第126-127页 |
| 第八章 D-aminoacylase 的固定化 | 第127-135页 |
| 8.1 材料与方法 | 第127-128页 |
| 8.1.1 试剂与材料 | 第127页 |
| 8.1.2 D-aminoacylase 的固定化 | 第127-128页 |
| 8.1.3 卡拉胶浓度的优化 | 第128页 |
| 8.1.4 D-氨基酰化酶浓度的优化 | 第128页 |
| 8.1.5 D-氨基酰化酶硬化条件的优化 | 第128页 |
| 8.1.6 固定化酶胶球机械强度的估测 | 第128页 |
| 8.1.7 D-aminoacylase 酶活测定 | 第128页 |
| 8.2 结果与讨论 | 第128-133页 |
| 8.2.1 卡拉胶浓度的优化 | 第128-129页 |
| 8.2.2 D-氨基酰化酶浓度的优化 | 第129-130页 |
| 8.2.3 D-氨基酰化酶硬化条件的优化 | 第130-132页 |
| 8.2.4 固定化 D-aminoacylase 应用 | 第132-133页 |
| 8.3 本章小结 | 第133-135页 |
| 第九章 结论 | 第135-139页 |
| 参考文献 | 第139-147页 |
| 致谢 | 第147-149页 |
| 攻博期间发表的学术论文 | 第149页 |
