| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 前言 | 第10-11页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-25页 |
| 1.1 甾体激素类药物合成 | 第11-16页 |
| 1.1.1 甾体激素类药物简介 | 第11-13页 |
| 1.1.2 甾体激素类药物合成现状 | 第13页 |
| 1.1.3 甾体药物生物合成 | 第13-16页 |
| 1.2 耶氏解脂酵母概况 | 第16-19页 |
| 1.2.1 耶氏解脂酵母简介及应用现状 | 第16-18页 |
| 1.2.2 耶氏解脂酵母合成甾体激素的研究 | 第18-19页 |
| 1.3 甾体类产物产量优化策略 | 第19-22页 |
| 1.3.1 底盘菌株前体供应的优化 | 第19-21页 |
| 1.3.2 产物合成关键酶活性优化 | 第21-22页 |
| 1.3.3 副产物降低或消除 | 第22页 |
| 1.4 本课题的主要研究内容与意义 | 第22-25页 |
| 第2章 材料与方法 | 第25-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-31页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第25页 |
| 2.1.2 实验质粒 | 第25-26页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第26-27页 |
| 2.1.4 实验试剂 | 第27-30页 |
| 2.1.5 实验试剂配制 | 第30-31页 |
| 2.2 DNA操作方法 | 第31-34页 |
| 2.2.1 目的片段的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 2.2.2 DNA提取及回收 | 第32页 |
| 2.2.3 酶切与连接 | 第32页 |
| 2.2.4 细胞转化 | 第32页 |
| 2.2.5 大肠杆菌蓝白斑筛选 | 第32-33页 |
| 2.2.6 菌落PCR验证 | 第33-34页 |
| 2.2.7 酵母基因组提取 | 第34页 |
| 2.3 基因元件的获得 | 第34-36页 |
| 2.3.1 异源基因元件的合成 | 第34-35页 |
| 2.3.2 内源基因元件的PCR扩增 | 第35-36页 |
| 2.4 菌株发酵与产物检测 | 第36-39页 |
| 2.4.1 摇瓶发酵 | 第36-37页 |
| 2.4.2 发酵罐发酵 | 第37页 |
| 2.4.3 发酵液的镜检 | 第37页 |
| 2.4.4 产物提取 | 第37页 |
| 2.4.5 产物检测 | 第37-39页 |
| 2.5 生物信息学分析 | 第39-41页 |
| 2.5.1 蛋白序列比对 | 第39页 |
| 2.5.2 系统发生树建立 | 第39页 |
| 2.5.3 蛋白二级结构预测 | 第39-41页 |
| 第3章 菜油甾醇在耶氏解脂酵母内的合成与优化 | 第41-65页 |
| 3.1 引言 | 第41-42页 |
| 3.2 关键酶DHCR7来源的筛选 | 第42-47页 |
| 3.2.1 引入不同来源DHCR7的菜油甾醇生产菌株的构建 | 第42-43页 |
| 3.2.2 不同来源DHCR7对菜油甾醇产量影响 | 第43-46页 |
| 3.2.3 DHCR7的生物信息学分析 | 第46-47页 |
| 3.3 DHCR7酶关键活性位点的研究 | 第47-52页 |
| 3.3.1 DHCR7_XlD409E突变菌株的获得 | 第47-49页 |
| 3.3.2 D409E突变对菜油甾醇产量影响 | 第49-52页 |
| 3.4 麦角固醇竞争路径的敲除 | 第52-54页 |
| 3.4.1 斑马鱼来源DHCR7基因组ERG5位点整合菌株的获得 | 第52页 |
| 3.4.2 非洲爪蟾及斑马鱼来源DHCR7菌株菜油甾醇产量比较 | 第52-54页 |
| 3.5 菜油甾醇关键调控靶点的鉴定 | 第54-59页 |
| 3.5.1 乙酰CoA代谢相关基因过表达菌株的构建 | 第54-56页 |
| 3.5.2 不同碳源下调控靶点对菜油甾醇产量影响 | 第56-59页 |
| 3.6 菜油甾醇高产菌株的发酵优化 | 第59-62页 |
| 3.7 小结 | 第62-65页 |
| 第4章 孕烯醇酮在耶氏解脂酵母内的合成与优化 | 第65-91页 |
| 4.1 引言 | 第65页 |
| 4.2 耶氏解脂酵母抗性标记筛选 | 第65-68页 |
| 4.2.1 不同抗性菌株的获得 | 第65-66页 |
| 4.2.2 抗性标记筛选与最适抗生素浓度的确定 | 第66-68页 |
| 4.3 CYP11A1、AdR、AdX的组合筛选与优化 | 第68-80页 |
| 4.3.1 CYP11A1、AdR、AdX线粒体转运肽截断 | 第68-69页 |
| 4.3.2 含不同来源CYP11A1、AdR、AdX组合的菌株的获得 | 第69-78页 |
| 4.3.3 不同来源P450scc组合的菌株孕烯醇酮产量比较 | 第78-80页 |
| 4.4 甾醇前体对孕烯醇酮合成的影响 | 第80-84页 |
| 4.4.1 胆固醇添加对孕烯醇酮产量的影响 | 第80-82页 |
| 4.4.2 菜油甾醇酯化对孕烯醇酮产量的影响 | 第82-83页 |
| 4.4.3 不同碳源培养对孕烯醇酮产量影响 | 第83-84页 |
| 4.5 CYP11A1定位于耶氏解脂酵母脂质体的研究 | 第84-88页 |
| 4.5.1 CYP11A1与脂质体膜固有蛋白的融合 | 第84-87页 |
| 4.5.2 融合不同定位蛋白对孕烯醇酮产量的影响 | 第87-88页 |
| 4.6 小结 | 第88-91页 |
| 第5章 结论与展望 | 第91-93页 |
| 5.1 结论 | 第91-92页 |
| 5.2 展望 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-101页 |
| 附录A | 第101-121页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第121-123页 |
| 致谢 | 第123-124页 |
