| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-17页 |
| 1.1 毕赤酵母表达系统 | 第11-12页 |
| 1.1.1 毕赤酵母表达系统的发展 | 第11页 |
| 1.1.2 甲基营养性酵母的甲醇利用途径 | 第11-12页 |
| 1.1.3 毕赤酵母AOX1启动子简介 | 第12页 |
| 1.2 毕赤酵母中被用来表达异源蛋白的启动子 | 第12-13页 |
| 1.3 酵母中与碳源阻遏相关的基因 | 第13页 |
| 1.4 酿酒酵母葡萄糖感受体基因SNF3和RGT2 | 第13-14页 |
| 1.5 汉逊酵母GCR1、HXS1和毕赤酵母HXT1基因 | 第14-15页 |
| 1.6 甲基营养型酵母的甲醇诱导相关调节因子 | 第15页 |
| 1.7 基于AOX1启动子的毕赤酵母表达系统的主要问题 | 第15-16页 |
| 1.8 利用葡萄糖生产异源蛋白的优点 | 第16页 |
| 1.9 本课题的研究背景及意义 | 第16-17页 |
| 第2章 毕赤酵母Aox酶葡萄糖脱阻遏突变菌株的筛选 | 第17-27页 |
| 2.1 前言 | 第17页 |
| 2.2 实验材料 | 第17-18页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第17页 |
| 2.2.2 培养基和培养条件 | 第17-18页 |
| 2.2.3 生物化学或分子生物学试剂 | 第18页 |
| 2.3 实验方法 | 第18-21页 |
| 2.3.1 平板显色检测Aox酶表达 | 第18页 |
| 2.3.2 筛选突变株步骤 | 第18页 |
| 2.3.3 毕赤酵母总蛋白的提取 | 第18-19页 |
| 2.3.4 Aox酶活测定 | 第19页 |
| 2.3.5 感受态毕赤酵母制备及电穿孔转化 | 第19页 |
| 2.3.6 毕赤酵母基因组的抽提 | 第19页 |
| 2.3.7 蓝色荧光标记过氧化物酶体菌株的构建 | 第19-20页 |
| 2.3.8 毕赤酵母GFP表达菌株构建 | 第20页 |
| 2.3.9 毕赤酵母GFP单拷贝表达菌株的筛选 | 第20-21页 |
| 2.3.10 流式细胞仪检测GFP表达量 | 第21页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第21-26页 |
| 2.4.1 葡萄糖脱阻遏突变株的筛选 | 第21页 |
| 2.4.2 BN8突变株在各种碳源中的Aox酶表达 | 第21-22页 |
| 2.4.3 葡萄糖、果糖和甘露糖诱导Aox表达发生在转录水平 | 第22-23页 |
| 2.4.4 BN8突变株AOX1启动子(P_(AOX1))驱动下绿色荧光蛋白(GFP)的表达 | 第23-24页 |
| 2.4.5 BN8突变株在葡萄糖、甘油和甲醇中的生长特性 | 第24-26页 |
| 2.5 小结 | 第26-27页 |
| 第3章 AOXl启动子葡萄糖脱阻遏突变株BN8受损基因的鉴定 | 第27-38页 |
| 3.1 前言 | 第27页 |
| 3.2 实验材料 | 第27页 |
| 3.3 实验方法 | 第27-28页 |
| 3.3.1 毕赤酵母中葡萄糖抑制相关基因同源基因的搜索 | 第27页 |
| 3.3.2 BN8突变株的各种基因的测序 | 第27-28页 |
| 3.3.3 Δhxs1菌株的构建 | 第28页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第28-37页 |
| 3.4.1 BN8突变基因的测序 | 第28-29页 |
| 3.4.2 BN8突变株PpHXS1基因回补实验 | 第29-30页 |
| 3.4.3 毕赤酵母HXS1基因缺失株Δhxs1的构建 | 第30-33页 |
| 3.4.4 Δhxs1菌株在添加2-脱氧葡萄糖的甲醇碳源中的生长 | 第33-34页 |
| 3.4.5 Ahxs1菌株在各种碳源中的Aox酶的表达 | 第34页 |
| 3.4.6 PpHXS1基因序列的生物信息学分析 | 第34-35页 |
| 3.4.7 PpHxs1突变对过氧化物酶体自噬产生的影响 | 第35-37页 |
| 3.5 小结 | 第37-38页 |
| 第4章 ΔPphxt1ΔPpmpp1、ΔPpmpp1和ΔPptrm1菌株的构建 | 第38-52页 |
| 4.1 前言 | 第38页 |
| 4.2 实验材料 | 第38页 |
| 4.3 实验方法 | 第38-39页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第39-51页 |
| 4.4.1 汉逊酵母MPPl同源基因的搜索 | 第39页 |
| 4.4.2 博伊丁假丝酵母Trm1p类似基因的搜索 | 第39-40页 |
| 4.4.3 毕赤酵母Δmpp1菌株的构建 | 第40-47页 |
| 4.4.4 毕赤酵母Δtrm1菌株的构建 | 第47-51页 |
| 4.5 小结 | 第51-52页 |
| 第5章 PpMPP1和PpTRM1的功能鉴定 | 第52-58页 |
| 5.1 前言 | 第52页 |
| 5.2 实验材料和方法 | 第52页 |
| 5.2.1 毕赤酵母总RNA的提取 | 第52页 |
| 5.2.2 反转录PCR制备cDNA | 第52页 |
| 5.2.3 实时定量PCR测定基因PpMPP1和PpTRMl的转录水平 | 第52页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第52-56页 |
| 5.3.1 Δhxt1ΔAmpp1、Δmpp1菌株Aox酶的表达 | 第52-53页 |
| 5.3.2 Δmpp1、Δhxt1Δmpp1菌株中AOX1启动子驱动下GFP的表达 | 第53-54页 |
| 5.3.3 Δtrm1菌株Aox酶的表达 | 第54-55页 |
| 5.3.4 Δtrm1菌株中AOX1启动子驱动下GFP的表达 | 第55-56页 |
| 5.3.5 PpTRM1和PpMPP1在甲醇和葡萄糖碳源中的转录 | 第56页 |
| 5.4 小结 | 第56-58页 |
| 第6章 结论与展望 | 第58-60页 |
| 6.1 结论 | 第58页 |
| 6.2 展望 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-64页 |
| 论文发表 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
