| 中文摘要 | 第2-3页 |
| Abstract | 第3页 |
| 引言 | 第7-9页 |
| 技术流程 | 第9-11页 |
| 第一章 材料和方法 | 第11-24页 |
| 1.1 材料 | 第11-12页 |
| 1.1.1 主要实验仪器 | 第11页 |
| 1.1.2 菌株与细胞株 | 第11页 |
| 1.1.3 主要实验试剂 | 第11-12页 |
| 1.2 方法 | 第12-24页 |
| 1.2.1 Jurkat细胞培养 | 第12-13页 |
| 1.2.1.1 细胞复苏与培养传代 | 第12页 |
| 1.2.1.2 Jurkat细胞冻存 | 第12-13页 |
| 1.2.2 正常人外周血淋巴细胞的提取 | 第13页 |
| 1.2.3 激光共聚焦显微镜观察细胞内CD59与Cbp的定位 | 第13页 |
| 1.2.4 质粒构建 | 第13-16页 |
| 1.2.4.1 载体的选择 | 第13页 |
| 1.2.4.2 靶基因序列的设计 | 第13-14页 |
| 1.2.4.3 寡核苷酸链退火成双链 | 第14页 |
| 1.2.4.4 pSUPER retro neo+gfp质粒的限制性双酶切与胶回收 | 第14-15页 |
| 1.2.4.4.1 pSUPER retro neo+gfp质粒的提取 | 第15页 |
| 1.2.4.4.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第15页 |
| 1.2.4.4.3 pSUPER空质粒的限制性内切酶双酶切 | 第15页 |
| 1.2.4.4.4 酶切大片段的胶回收 | 第15页 |
| 1.2.4.5 目的基因与目的载体的连接 | 第15-16页 |
| 1.2.4.6 连接载体转化JM109感受态大肠杆菌(TSS法) | 第16页 |
| 1.2.5 重组载体pSUPER-siCbp的鉴定 | 第16-17页 |
| 1.2.5.1 重组载体的菌液及DNA PCR鉴定 | 第16-17页 |
| 1.2.5.2 重组载体的双酶切鉴定 | 第17页 |
| 1.2.5.3 重组载体的DNA测序鉴定 | 第17页 |
| 1.2.6 细胞电转染 | 第17-18页 |
| 1.2.7 RT-PCR | 第18-19页 |
| 1.2.7.1 细胞总RNA的提取(Trizol法) | 第18页 |
| 1.2.7.2 反转录反应 | 第18-19页 |
| 1.2.7.3 PCR反应 | 第19页 |
| 1.2.8 western blot | 第19-21页 |
| 1.2.9 各质粒的扩增及酶切鉴定 | 第21页 |
| 1.2.10 功能检测 | 第21-22页 |
| 1.2.10.1 Jurkat细胞电转染 | 第21页 |
| 1.2.10.2 采用RT-PCR和western blotting方法检测各组Cbp的表达 | 第21页 |
| 1.2.10.3 CD59单克隆抗体交联刺激 | 第21-22页 |
| 1.2.10.4 细胞处理 | 第22页 |
| 1.2.10.5 MTT检测细胞增殖 | 第22页 |
| 1.2.10.6 ELISA检测细胞中IL-2的分泌量 | 第22页 |
| 1.2.10.7 western blot检测细胞活化后Csk、ZAP-70和Fyn激酶酪氨酸磷酸化水平 | 第22页 |
| 1.2.11 统计学分析 | 第22-24页 |
| 第二章 实验结果 | 第24-36页 |
| 2.1. Jurkat细胞的培养 | 第24页 |
| 2.2. 激光共聚焦显微镜观察CD3、CD59及Cbp的定位及相互关系 | 第24-25页 |
| 2.3 成功构建pSUPER-siCbp重组质粒 | 第25-26页 |
| 2.3.1 提取pSUPER retro neo+gfp质粒 | 第25-26页 |
| 2.3.2 pSUPER retro neo+gfp质粒的双酶切 | 第26页 |
| 2.3.3 pSUPER-siCbp重组质粒 | 第26页 |
| 2.4. pSUPER-siCbp重组质粒的鉴定 | 第26-28页 |
| 2.4.1 菌液PCR及DNA PCR鉴定 | 第27页 |
| 2.4.2 pSUPER-siCbp重组质粒的酶切鉴定 | 第27页 |
| 2.4.3 pSUPER-siCbp重组质粒的测序结果 | 第27-28页 |
| 2.5 Jurkat细胞电转染 | 第28-29页 |
| 2.6 RT-PCR检测Cbp基因的表达 | 第29-30页 |
| 2.7 Western blot检测Cbp蛋白的表达 | 第30页 |
| 2.8 重组质粒酶切鉴定 | 第30-31页 |
| 2.9 功能检测 | 第31-36页 |
| 2.9.1 Jurkat细胞电转染 | 第31-32页 |
| 2.9.2 Cbp分子在基因和蛋白水平的表达 | 第32-33页 |
| 2.9.3 Western blot检测处理后细胞的Csk、p-ZAP-70和p-Fyn蛋白的表达 | 第33-34页 |
| 2.9.4 MTT检测Jurkat细胞增殖 | 第34-35页 |
| 2.9.5 ELISA定量检测IL-2含量 | 第35-36页 |
| 第三章 讨论 | 第36-38页 |
| 结论 | 第38-39页 |
| 参考文献 | 第39-41页 |
| 综述 | 第41-53页 |
| 综述的参考文献 | 第48-53页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第53-54页 |
| 附录 | 第54-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
