| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第14-27页 |
| 1.1 前言 | 第14页 |
| 1.2 肾损伤 | 第14-18页 |
| 1.2.1 肾损伤的介绍及分类 | 第14-15页 |
| 1.2.2 AKI生物标志物 | 第15-18页 |
| 1.3 NGAL | 第18-20页 |
| 1.3.1 NGAL基因特点与表达 | 第18页 |
| 1.3.2 NGAL蛋白结构 | 第18-20页 |
| 1.3.3 NGAL正常组织分布 | 第20页 |
| 1.3.4 NGAL临床应用价值 | 第20页 |
| 1.4 质控品 | 第20-24页 |
| 1.4.1 质控品简介 | 第20-22页 |
| 1.4.2 重组蛋白的冷冻干燥 | 第22页 |
| 1.4.3 冷冻干燥过程影响蛋白质稳定性的因素 | 第22页 |
| 1.4.4 蛋白冻干保护剂和保护机理 | 第22-23页 |
| 1.4.5 蛋白冻干保护剂种类及作用 | 第23-24页 |
| 1.4.6 冻干工艺优化 | 第24页 |
| 1.5 论文研究内容及意义 | 第24-27页 |
| 1.5.1 研究背景及意义 | 第24-25页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 重组表达载体pCold-NGAL的构建 | 第27-39页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 材料与设备 | 第27-29页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第27页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第27-28页 |
| 2.2.3 实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.2.4 常用溶液及培养基配制 | 第29页 |
| 2.2.4.1 常用溶液 | 第29页 |
| 2.2.4.2 培养基 | 第29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-35页 |
| 2.3.1 重组质粒pUC57-NGAL的提取及鉴定 | 第29-31页 |
| 2.3.2 质粒pCold I的提取及鉴定 | 第31-32页 |
| 2.3.3 质粒pUC57-NGAL及pCold I双酶切及产物回收 | 第32-33页 |
| 2.3.4 重组表达载体pCold-NGAL的构建及鉴定 | 第33-35页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第35-38页 |
| 2.4.1 重组质粒pUC57-NGAL双酶切鉴定 | 第35页 |
| 2.4.2 质粒pCold I酶切鉴定 | 第35-36页 |
| 2.4.3 重组质粒pCold-NGAL双酶切鉴定 | 第36-37页 |
| 2.4.4 重组质粒pCold-NGAL测序鉴定 | 第37-38页 |
| 2.5 本章小结 | 第38-39页 |
| 第三章 pCold-NGAL在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第39-53页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 材料与设备 | 第39-41页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第39-40页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第40页 |
| 3.2.3 主要设备 | 第40-41页 |
| 3.2.4 常用溶液的配制 | 第41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-45页 |
| 3.3.1 重组质粒pCold-NGAL转化BL21(DE3)plysS | 第41-42页 |
| 3.3.2 pCold-NGAL小量诱导表达 | 第42页 |
| 3.3.3 pCold-NGAL蛋白SDS-PAGE鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3.4 pCold-NGAL诱导表达条件优化 | 第43-44页 |
| 3.3.5 pCold-NGAL大量诱导表达 | 第44页 |
| 3.3.6 重组蛋白的镍柱亲和层析纯化 | 第44页 |
| 3.3.6.1 重组蛋白的样品制备 | 第44页 |
| 3.3.6.2 重组蛋白的镍柱亲和纯化 | 第44页 |
| 3.3.7 重组蛋白NGAL的SDS-PAGE和Western Blot检测 | 第44-45页 |
| 3.3.7.1 SDS-PAGE检测 | 第44-45页 |
| 3.3.7.2 Western Blot检测 | 第45页 |
| 3.3.8 重组蛋白NGAL活性鉴定 | 第45页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第45-52页 |
| 3.4.1 pCold-NGAL小量鉴定 | 第45-47页 |
| 3.4.2 pCold-NGAL诱导表达条件优化的鉴定 | 第47-50页 |
| 3.4.2.1 最佳诱导温度和时间的鉴定 | 第47-49页 |
| 3.4.2.2 IPTG最佳诱导浓度的鉴定 | 第49-50页 |
| 3.4.3 目的蛋白分离纯化结果的鉴定 | 第50-51页 |
| 3.4.4 目的蛋白Western Blot鉴定 | 第51页 |
| 3.4.5 目的蛋白活性鉴定 | 第51-52页 |
| 3.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 NGAL冻干稀释液的制备 | 第53-61页 |
| 4.1 引言 | 第53页 |
| 4.2 材料与设备 | 第53-54页 |
| 4.2.1 材料与试剂 | 第53页 |
| 4.2.2 实验设备 | 第53-54页 |
| 4.3 NGAL冻干制剂缓冲液的制备 | 第54页 |
| 4.4 NGAL冻干保护剂筛选 | 第54-60页 |
| 4.4.1 冻干赋形剂筛选 | 第55-57页 |
| 4.4.1.1 实验方法 | 第55页 |
| 4.4.1.2 冻干赋形剂筛选结果与讨论 | 第55-57页 |
| 4.4.2 冻干蛋白保护剂筛选 | 第57-58页 |
| 4.4.2.1 实验方法 | 第57-58页 |
| 4.4.2.2 冻干蛋白保护剂筛选结果与讨论 | 第58页 |
| 4.4.3 NGAL冻干稀释液的持续优化 | 第58-60页 |
| 4.4.3.1 实验方法 | 第58-59页 |
| 4.4.3.2 NGAL冻干稀释液优化结果与讨论 | 第59-60页 |
| 4.5 本章小结 | 第60-61页 |
| 第五章 NGAL冻干质控品的制备及性能评价 | 第61-72页 |
| 5.1 引言 | 第61页 |
| 5.2 材料与设备 | 第61-62页 |
| 5.2.1 材料与试剂 | 第61页 |
| 5.2.2 实验设备 | 第61-62页 |
| 5.3 实验方法 | 第62-64页 |
| 5.3.1 NGAL冻干质控品的制备 | 第62页 |
| 5.3.2 NGAL质控品性能评价 | 第62-64页 |
| 5.3.2.1 质控品外观 | 第62页 |
| 5.3.2.2 质控品复溶性 | 第62页 |
| 5.3.2.3 质控品水分含量测定 | 第62页 |
| 5.3.2.4 NGAL质控品批内精密度检测 | 第62-63页 |
| 5.3.2.5 NGAL质控品稳定性研究 | 第63页 |
| 5.3.2.6 NGAL质控品在不同试剂盒上的反应性 | 第63-64页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第64-70页 |
| 5.4.1 NGAL质控品物理性能评价 | 第64-65页 |
| 5.4.2 NGAL质控品批内精密度评价结果 | 第65页 |
| 5.4.3 NGAL质控品 4℃复溶稳定性 | 第65-66页 |
| 5.4.4 NGAL质控品 25℃复溶稳定性 | 第66-67页 |
| 5.4.5 NGAL质控品 37℃热稳定性 | 第67-68页 |
| 5.4.6 NGAL质控品 50℃热稳定性 | 第68页 |
| 5.4.7 NGAL质控品反复冻融稳定性 | 第68-69页 |
| 5.4.8 NGAL质控品 4℃长期保存稳定性 | 第69-70页 |
| 5.4.9 NGAL质控品第三方检测 | 第70页 |
| 5.5 本章小结 | 第70-72页 |
| 结论与展望 | 第72-74页 |
| 一、结论 | 第72页 |
| 二、创新点 | 第72-73页 |
| 三、展望 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-85页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 附件 | 第87页 |
