| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 英文缩写词汇及其含义说明 | 第7-13页 |
| 一、引言 | 第13-19页 |
| 1 鸭疫里默氏杆菌研究概况 | 第13页 |
| 2 OmpA基因编码蛋白的特点 | 第13-16页 |
| 2.1 OmpA蛋白的结构特点 | 第13-14页 |
| 2.2 OmpA蛋白的功能 | 第14-16页 |
| 2.2.1 致病作用 | 第14-15页 |
| 2.2.2 支撑细胞外膜骨架 | 第15页 |
| 2.2.3 参与生物膜的形成 | 第15页 |
| 2.2.4 作为外源蛋白的表面呈现载体 | 第15-16页 |
| 2.2.5 免疫原性 | 第16页 |
| 3 OmpA的基因特点 | 第16-17页 |
| 4 OmpA其它特性 | 第17页 |
| 4.1 中性粒细胞弹性蛋白酶降解外膜蛋白杀灭大肠杆菌 | 第17页 |
| 4.2 膜间质分子伴侣Skp捕获外膜蛋白 | 第17页 |
| 4.3 外膜蛋白参与革兰氏阴性菌对异丙醇耐受的调节 | 第17页 |
| 5 研究的目的和意义 | 第17-19页 |
| 二、试验研究 | 第19-51页 |
| 1 材料 | 第19-22页 |
| 1.1 菌株、菌种、质粒、血清和动物 | 第19页 |
| 1.2 试剂 | 第19页 |
| 1.3 主要溶液的配制 | 第19-21页 |
| 1.3.1 RA基因组提取相关试剂 | 第19-20页 |
| 1.3.2 基因克隆相关试剂 | 第20页 |
| 1.3.3 基因表达相关试剂 | 第20-21页 |
| 1.3.4 弗氏不完全佐剂的配制 | 第21页 |
| 1.3.5 Western-blot相关试剂的配制 | 第21页 |
| 1.3.6 ELISA相关溶液的配制 | 第21页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第21-22页 |
| 2 方法 | 第22-31页 |
| 2.1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析 | 第22页 |
| 2.2 RA OmpA基因的克隆和表达 | 第22-25页 |
| 2.2.1 细菌培养及基因组DNA的提取 | 第22页 |
| 2.2.2 RA OmpA基因引物设计与扩增 | 第22-23页 |
| 2.2.3 DH5 α感受态的制备、重组T克隆质粒pJET1.2/OmpA的构建及鉴定 | 第23页 |
| 2.2.4 原核表达pET-32a(+)/OmpA重组质粒的构建和鉴定 | 第23-24页 |
| 2.2.5 重组表达质粒pET-32a(+)/OmpA的表达 | 第24页 |
| 2.2.6 OmpA重组表达蛋白诱导条件的优化 | 第24-25页 |
| 2.3 OmpA重组表达蛋白的纯化及鉴定 | 第25-27页 |
| 2.3.1 OmpA重组表达蛋白的纯化 | 第25页 |
| 2.3.2 OmpA重组表达蛋白的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.3 兔抗重组OmpA蛋白多克隆抗体的制备 | 第26页 |
| 2.3.4 兔抗OmpA IgG的纯化与鉴定 | 第26-27页 |
| 2.4 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立 | 第27-29页 |
| 2.4.1 鸭抗鸭疫里默氏杆菌ATCC株阳性血清的制备 | 第27页 |
| 2.4.2 间接ELISA的基本操作程序 | 第27页 |
| 2.4.3 抗原的最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定 | 第27页 |
| 2.4.4 酶标二抗最佳工作浓度的确定 | 第27-28页 |
| 2.4.5 酶标二抗作用时间的确定 | 第28页 |
| 2.4.6 阴阳性血清最佳作用时间的确定 | 第28页 |
| 2.4.7 封闭液的确定 | 第28页 |
| 2.4.8 底物最佳作用时间确定 | 第28页 |
| 2.4.9 阴阳性临界值的确定 | 第28-29页 |
| 2.4.10 重复性试验 | 第29页 |
| 2.4.11 特异性试验 | 第29页 |
| 2.4.12 符合性试验 | 第29页 |
| 2.5 重组表达蛋白的免疫原性研究 | 第29-31页 |
| 2.5.1 体液免疫水平的检测 | 第29-30页 |
| 2.5.2 细胞免疫水平的检测 | 第30-31页 |
| 3 结果 | 第31-46页 |
| 3.1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析 | 第31-36页 |
| 3.1.1 RA OmpA蛋白质的组分析 | 第31页 |
| 3.1.2 信号肽切割位点和跨膜区预测 | 第31-32页 |
| 3.1.3 抗原性分析 | 第32-33页 |
| 3.1.4 功能位点预测 | 第33页 |
| 3.1.5 蛋白质亚细胞定位分析 | 第33页 |
| 3.1.6 二级结构预测与密码子氨基酸序列保守结构域预测 | 第33-34页 |
| 3.1.7 密码子偏性分析 | 第34页 |
| 3.1.8 系统进化树分析 | 第34-36页 |
| 3.2 RA OmpA基因克隆表达、蛋白纯化及抗体制备 | 第36-39页 |
| 3.2.1 RA OmpA基因的扩增、T克隆及亚克隆的构建 | 第36-38页 |
| 3.2.2 OmpA基因诱导表达、纯化及Western blot检测重组蛋白 | 第38-39页 |
| 3.2.3 兔抗RA OmpA抗体效价的检测及抗体IgG的粗提 | 第39页 |
| 3.3 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立 | 第39-43页 |
| 3.3.1 抗原的最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定 | 第39-40页 |
| 3.3.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定 | 第40页 |
| 3.3.3 酶标二抗作用时间的确定 | 第40-41页 |
| 3.3.4 阴阳性血清最佳作用时间的确定 | 第41页 |
| 3.3.5 封闭液的确定 | 第41页 |
| 3.3.6 底物最佳作用时间确定 | 第41页 |
| 3.3.7 阴阳性临界值的确定 | 第41页 |
| 3.3.8 重复性试验 | 第41-42页 |
| 3.3.9 特异性试验 | 第42-43页 |
| 3.4 重组表达蛋白的免疫原性研究 | 第43-46页 |
| 3.4.1 人工免疫鸭抗体水平监测结果 | 第43页 |
| 3.4.2 细胞因子的检测结果 | 第43-46页 |
| 4 讨论 | 第46-51页 |
| 4.1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析 | 第46-47页 |
| 4.2 RA OmpA基因的克隆表达、蛋白纯化及抗体制备 | 第47页 |
| 4.3 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立 | 第47-48页 |
| 4.4 重组表达蛋白的免疫原性研究 | 第48-51页 |
| 三、结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
| 作者简介及攻读硕士学位期间论文发表 | 第58页 |
