| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 1. 前言 | 第11-22页 |
| ·纤维素酶概述 | 第11-15页 |
| ·纤维素酶组成及作用 | 第11-12页 |
| ·纤维素酶的作用机理 | 第12-13页 |
| ·纤维素酶的来源 | 第13页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第13-14页 |
| ·纤维素酶存在的问题及发展方向 | 第14-15页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第15-16页 |
| ·巴斯德毕赤酵母系统的优点 | 第15-16页 |
| ·影响外源基因在毕赤酵母系统中表达的因素 | 第16页 |
| ·密码子改造的理论依据 | 第16-18页 |
| ·信号肽 | 第18-22页 |
| ·信号肽简介 | 第18页 |
| ·信号肽的作用 | 第18-19页 |
| ·信号肽的选择 | 第19-20页 |
| ·信号肽国内外研究进展 | 第20-22页 |
| ·本研究的前工作、目的和意义 | 第22页 |
| 2 实验材料 | 第22-27页 |
| ·质粒与菌株 | 第22-24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·纤维素酶活力测定溶液 | 第25页 |
| ·SDS-PAGE电泳药品及试剂 | 第25-27页 |
| 3 实验方法 | 第27-39页 |
| ·表达载体信号肽的改造 | 第27-28页 |
| ·引物的设计 | 第28页 |
| ·未改造内切葡聚糖酶基因End的获得 | 第28-31页 |
| ·pUC18-End质粒提取 | 第28-29页 |
| ·内切葡聚糖酶基因高保真扩增 | 第29页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第29页 |
| ·PCR回收产物加“A” | 第29-30页 |
| ·连接 | 第30页 |
| ·转化 | 第30页 |
| ·阳性克隆菌落的筛选鉴定 | 第30页 |
| ·含End基因质粒的提取 | 第30-31页 |
| ·双酶切含End基因的质粒 | 第31页 |
| ·回收酶切后的内切葡聚糖酶基因 | 第31页 |
| ·重组表达载体pBluescript-HS-E-Ends的构建 | 第31-34页 |
| ·改造内切葡聚糖酶基因Ends和HS的获得 | 第31-32页 |
| ·表达载体DNA的预处理 | 第32页 |
| ·重组质粒pBluescript-HS-Ends的连接 | 第32页 |
| ·重组质粒pBluescript-HS-Ends的转化 | 第32-33页 |
| ·刚性克隆菌株的筛选及鉴定 | 第33-34页 |
| ·重组质粒pPIC9K-HS-End/Ends的构建 | 第34-35页 |
| ·pPIC9K-HS-Ends的构建 | 第34-35页 |
| ·pPIC9K-HS-End的构建 | 第35页 |
| ·表达载体pPIC9K-HS-End/Ends的电击转化 | 第35-36页 |
| ·酵母GS115感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·表达载体pPIC9K-HS-End/Ends的线性化处理 | 第35-36页 |
| ·pPIC9K-HS-End/Ends的电击转化 | 第36页 |
| ·重组转化子的筛选 | 第36-38页 |
| ·酶活测定筛选转化子 | 第36-37页 |
| ·转化子总DNA的PCR鉴定 | 第37-38页 |
| ·转化子的诱导表达和酶活性测定 | 第38-39页 |
| ·转化子的诱导培养 | 第38页 |
| ·酶活性测定 | 第38-39页 |
| ·不同诱导温度酶活的测定 | 第39页 |
| ·重组酵母的遗传稳定性检测 | 第39页 |
| 4. 结果 | 第39-55页 |
| ·表达载体信号肽的改造 | 第39-40页 |
| ·End基因的获得 | 第40-41页 |
| ·End基因的PCR扩增 | 第40-41页 |
| ·End基因的“T”克隆 | 第41页 |
| ·含重组表达载体pBluescript-HS-Ends的DH5α阳性克隆的构建 | 第41-43页 |
| ·HS和Ends基因的获得 | 第41-42页 |
| ·DH5α(pBluescript-HS-Ends)的筛选 | 第42-43页 |
| ·含表达载体pPIC9K-HS-End/Ends的DH5α阳性克隆的构建 | 第43-48页 |
| ·DH5α(pPIC9K-HS-Ends)的构建 | 第43-45页 |
| ·DH5α(pPIC9K-HS-End)的构建 | 第45-48页 |
| ·重组载体pPIC9K-HS-End/Ends的转化及重组酵母的筛选 | 第48-50页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第50页 |
| ·转化子的诱导表达及酶活性的测定 | 第50-51页 |
| ·不同条件下酶活的测定 | 第51-53页 |
| ·诱导时间对酵母工程菌所产酶的影响 | 第51-52页 |
| ·诱导温度对酵母工程菌所产酶的影响 | 第52-53页 |
| ·重组酵母的遗传稳定性检测 | 第53-55页 |
| 5. 讨论 | 第55-62页 |
| ·α-Factor密码子改造设计的理论依据 | 第55页 |
| ·改造设计的α-Factor | 第55-56页 |
| ·信号肽改造对外源基因分泌表达的影响 | 第56-59页 |
| ·低温诱导对外源基因分泌表达的影响 | 第59页 |
| ·改造方案改善的探讨 | 第59-62页 |
| 6. 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
