| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-10页 |
| 本文缩略语表 | 第10-17页 |
| 引言 | 第17-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-45页 |
| 第一节 木聚糖结构与性质 | 第19-21页 |
| 1 木聚糖的结构 | 第19-20页 |
| 2 木聚糖性质与抗营养作用 | 第20-21页 |
| 第二节 木聚糖降解酶及其生化特性 | 第21-25页 |
| 1 木聚糖酶降解系统 | 第21-23页 |
| ·β-1,4-内切木聚糖酶 | 第21-22页 |
| ·β-木糖苷酶 | 第22页 |
| ·其他相关水解酶类 | 第22-23页 |
| 2 木聚糖酶的族簇分类 | 第23-24页 |
| 3 木聚糖酶的生化特性 | 第24-25页 |
| ·产酶菌株 | 第24页 |
| ·木聚糖酶生化特性 | 第24-25页 |
| 第三节 木聚糖酶的分子结构和催化机制 | 第25-31页 |
| 1 木聚糖酶分子结构 | 第25-29页 |
| ·催化域 | 第26-27页 |
| ·底物结合域 | 第27-28页 |
| ·连接序列 | 第28-29页 |
| ·耐热结构域 | 第29页 |
| ·其它结构域 | 第29页 |
| 2 木聚糖酶催化机制 | 第29-31页 |
| ·木聚糖酶催化特性 | 第29-30页 |
| ·木聚糖酶催化的分子机制 | 第30-31页 |
| 第四节 木聚糖酶分子生物学与基因工程 | 第31-37页 |
| 1 木聚糖基因及其克隆 | 第31-33页 |
| ·细菌木聚糖酶基因 | 第32-33页 |
| ·真菌木聚糖酶基因 | 第33页 |
| ·其它木聚糖酶基因 | 第33页 |
| 2 木聚糖酶基因工程 | 第33-37页 |
| ·木聚糖酶基因的表达 | 第34-36页 |
| ·木聚糖酶分子改造 | 第36-37页 |
| 第五节 耐热木聚糖酶研究进展 | 第37-41页 |
| 1 耐热木聚糖酶来源 | 第37-38页 |
| 2 耐热木聚糖酶分子结构 | 第38-40页 |
| ·热稳定区 | 第38页 |
| ·二硫键 | 第38-39页 |
| ·盐桥 | 第39页 |
| ·特殊氨基酸 | 第39-40页 |
| 3 耐热木聚糖酶基因的克隆与表达 | 第40-41页 |
| 第六节 木聚糖酶的应用研究 | 第41-45页 |
| 1 木聚糖酶在饲料工业中的应用 | 第41-42页 |
| 2 木聚糖酶在食品工业中的应用 | 第42-43页 |
| 3 木聚糖酶在造纸工业中的应用 | 第43页 |
| 4 其它 | 第43页 |
| 5 木聚糖酶应用中存在问题 | 第43-45页 |
| 第二章 本研究的目的、内容、意义与技术路线 | 第45-47页 |
| 1.研究目的 | 第45页 |
| 2.研究内容 | 第45页 |
| 3.研究的意义 | 第45页 |
| 4.研究的技术路线 | 第45-47页 |
| 第三章 试验研究 | 第47-120页 |
| 第一节 里氏木霉Xyn2基因的克隆和序列分析 | 第47-59页 |
| 1 基因克隆策略 | 第47页 |
| 2 试验材料 | 第47-49页 |
| 3 试验方法 | 第49-53页 |
| ·木霉诱导培养 | 第49-50页 |
| ·总RNA提取 | 第50页 |
| ·一步式RT-PCR | 第50-51页 |
| ·核酸电泳 | 第51页 |
| ·DNA回收 | 第51页 |
| ·DNA连接 | 第51-52页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第52页 |
| ·阳性克隆筛选与初筛 | 第52页 |
| ·阳性质粒提取 | 第52-53页 |
| ·双酶切鉴定 | 第53页 |
| ·基因序列测定与分析 | 第53页 |
| 4 试验结果 | 第53-56页 |
| ·总RNA提取 | 第53-54页 |
| ·RT-PCR结果 | 第54页 |
| ·阳性克隆筛选与鉴定 | 第54页 |
| ·核苷酸序列分析比较 | 第54-56页 |
| 5 讨论 | 第56-59页 |
| 第二节 Xyn2基因在大肠杆菌中的表达及重组酶酶学性质研究 | 第59-77页 |
| 一、Xyn2基因在大肠杆菌中的表达 | 第59-70页 |
| 1 表达策略 | 第59-60页 |
| 2 试验材料 | 第60-61页 |
| 3 试验方法 | 第61-65页 |
| ·T克隆质粒pMD18-T-Xyn2抽提 | 第61页 |
| ·pMD18-T-Xyn2双酶切 | 第61页 |
| ·表达载体pET-28α(+)和pET-30α(+)双酶切 | 第61-62页 |
| ·酶切产物回收 | 第62页 |
| ·DNA连接反应 | 第62页 |
| ·大肠杆菌感受态DH5α制作与转化 | 第62页 |
| ·阳性质粒筛选 | 第62-63页 |
| ·菌落PCR | 第63页 |
| ·重组质粒抽提与鉴定 | 第63页 |
| ·大肠杆菌感受态BL21制作、转化及筛选 | 第63页 |
| ·重组大肠杆菌诱导表达 | 第63-64页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第64页 |
| ·木聚糖酶酶活测定 | 第64-65页 |
| 4 试验结果 | 第65-68页 |
| ·T克隆质粒与表达载体双酶切 | 第65-66页 |
| ·菌落PCR | 第66页 |
| ·重组表达质粒酶切鉴定结果 | 第66-68页 |
| ·SDS-PAGE检测结果 | 第68页 |
| ·酶活测定 | 第68页 |
| 5 讨论 | 第68-70页 |
| 二、大肠杆菌重组Xyn2的分离纯化及酶学性质分析 | 第70-77页 |
| 1 试验材料 | 第70-71页 |
| 2 试验方法 | 第71-72页 |
| ·重组大肠杆菌诱导培养 | 第71页 |
| ·重组酶纯化 | 第71-72页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第72页 |
| ·木聚糖酶酶活测定 | 第72页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第72页 |
| ·重组酶酶学性质分析 | 第72页 |
| 3 结果 | 第72-75页 |
| ·重组酶纯化结果 | 第72-74页 |
| ·重组酶Xyn228和Xyn230酶学性质分析 | 第74-75页 |
| 4 讨论 | 第75-77页 |
| 第三节 Xyn2基因在毕赤酵母中的分泌表达及重组酶酶学性质研究 | 第77-98页 |
| 一、Xyn2基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第77-89页 |
| 1 表达策略 | 第77页 |
| 2 试验材料 | 第77-80页 |
| 3 试验方法 | 第80-84页 |
| ·质粒pMD18-T-Xyn2提取与双酶切 | 第80页 |
| ·表达载体pPICZαA双酶切 | 第80页 |
| ·酶切产物回收 | 第80页 |
| ·DNA连接反应 | 第80-81页 |
| ·大肠杆菌DH5α制作与转化 | 第81页 |
| ·阳性转化子筛选 | 第81-82页 |
| ·重组表达质粒pPICZαA-Xyn2大量制备 | 第82页 |
| ·质粒pPICZαA-Xyn2线性化与纯化 | 第82-83页 |
| ·毕赤酵母X-33感受态度制备 | 第83页 |
| ·毕赤酵母X-33电转化 | 第83页 |
| ·重组酵母筛选 | 第83-84页 |
| ·阳性转化子诱导培养 | 第84页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第84页 |
| ·表达产物活性检测(Zymogram) | 第84页 |
| 4 试验结果 | 第84-88页 |
| ·毕赤酵母表达载体pPICZαA-Xyn2的构建 | 第84-86页 |
| ·质粒pPICZαA-Xyn2的大量提取与线性化 | 第86页 |
| ·毕赤酵母X-33电转化及阳性重组子筛选 | 第86-87页 |
| ·阳性重组子诱导培养及酶活分析 | 第87-88页 |
| ·SDS-PAGE与Zymogram分析 | 第88页 |
| 5 讨论 | 第88-89页 |
| 二、毕赤酵母重组木聚糖酶PTX2酶学性质研究 | 第89-98页 |
| 1 试验材料 | 第89-90页 |
| 2 试验方法 | 第90-92页 |
| ·重组酵母PX-1小规模诱导培养 | 第90页 |
| ·重组酶PTX2超滤浓缩 | 第90页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第90-91页 |
| ·木聚糖酶酶活测定 | 第91页 |
| ·PTX2酶学性质分析 | 第91页 |
| ·PTX2酶促反应动力学参数测定 | 第91页 |
| ·PTX2对纤维素和木聚糖结合力比较 | 第91页 |
| ·PTX2水解产物薄层层析(TLC) | 第91-92页 |
| 3 试验结果 | 第92-95页 |
| ·重组酵母PX-1小规模诱导培养 | 第92页 |
| ·重组酶PTX2浓缩 | 第92页 |
| ·重组酶PTX2酶学性质分析 | 第92-93页 |
| ·米氏常数和催化常数 | 第93-94页 |
| ·PTX2对纤维素和木聚糖结合力比较 | 第94页 |
| ·PTX2水解产物薄层层析 | 第94-95页 |
| 4 讨论 | 第95-98页 |
| 第四节 杂合耐热木聚糖酶基因Xyn2-A2的设计及其在毕赤酵母中的表达 | 第98-112页 |
| 一、杂合木聚糖酶基因Xyn2-A2的设计及毕赤酵母表达载体的构建 | 第98-104页 |
| 1 Xyn2-A2设计及表达载体构建策略 | 第98页 |
| 2 试验材料 | 第98页 |
| 3 试验方法 | 第98-100页 |
| ·杂合基因Xyn2-A2的克隆 | 第99页 |
| ·杂合基因Xyn2-A2毕赤酵母表达载体构建 | 第99-100页 |
| 4 试验结果 | 第100-103页 |
| ·杂合基因Xyn2-A2的克隆 | 第100-101页 |
| ·毕赤酵母表达载体pPICZαA-Xyn2-A2的构建 | 第101-103页 |
| 5 讨论 | 第103-104页 |
| 二、杂合基因Xyn2-A2在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质研究 | 第104-112页 |
| 1 试验材料 | 第104-105页 |
| 2 试验方法 | 第105页 |
| 3 试验结果 | 第105-109页 |
| ·表达载体pPICZαA-Xyn2-A2线性化 | 第105页 |
| ·毕赤酵母X-33电转化及阳性重组子筛选 | 第105-106页 |
| ·阳性重组子诱导培养及酶活分析 | 第106-107页 |
| ·SDS-PAGE与Zymogram分析 | 第107页 |
| ·重组酵母PXC-1小规模诱导培养 | 第107页 |
| ·重组酶PTXC2浓缩 | 第107-108页 |
| ·重组酶PTXC2酶学性质分析 | 第108-109页 |
| 4 讨论 | 第109-112页 |
| 第五节 重组酶PTX2小规模制备及其应用研究 | 第112-120页 |
| 一、重组酶PTX2小规模制备 | 第112-115页 |
| 1 试验材料 | 第112-113页 |
| 2 试验方法 | 第113-114页 |
| ·发酵罐灭菌 | 第113页 |
| ·培养方法 | 第113页 |
| ·SDS-PAGE与酶活测定 | 第113-114页 |
| 3 试验结果 | 第114页 |
| ·菌体增殖 | 第114页 |
| ·诱导产酶 | 第114页 |
| 4 讨论 | 第114-115页 |
| 二、重组酶PTX2对仔猪生产性能的影响 | 第115-120页 |
| 1 材料与方法 | 第115-117页 |
| ·试验设计与动物饲养 | 第115-116页 |
| ·试验饲粮 | 第116页 |
| ·样品采集与分析 | 第116-117页 |
| ·数据统计分析 | 第117页 |
| 2 试验结果 | 第117-118页 |
| ·重组酶PTX2对仔猪生产性能的影响 | 第117页 |
| ·重组酶PTX2对仔猪养分表观消化率的影响 | 第117-118页 |
| 3 讨论 | 第118-120页 |
| 第四章 全文总结、创新点和今后研究展望 | 第120-125页 |
| 一、全文总结 | 第120-122页 |
| 二、本文主要创新点 | 第122页 |
| 三、今后需进一步研究的问题 | 第122-125页 |
| 参考文献 | 第125-137页 |
| 附录一 | 第137-138页 |
| 附录二 | 第138-139页 |
| 附录三 | 第139-140页 |
| 附录四 | 第140-142页 |
| 攻读博士学位期间发表和录用的主要论文 | 第142-143页 |
| 致谢 | 第143页 |
