| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 符号说明 | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-31页 |
| 1. 植物异三聚体 G 蛋白研究进展 | 第13-22页 |
| ·植物异三聚体G 蛋白的结构 | 第14-16页 |
| ·植物异三聚体G 蛋白的偶联信号 | 第16-18页 |
| ·与 G 蛋白相关的胞外环境信号 | 第16页 |
| ·GPCR | 第16-17页 |
| ·与 G 蛋白作用的效应器 | 第17-18页 |
| ·G 蛋白信号传递中的调节子 | 第18页 |
| ·异三聚体 G 蛋白在植物细胞信号转导中的作用 | 第18-22页 |
| ·激素信号 | 第19-21页 |
| ·生长素信号 | 第19-20页 |
| ·ABA 信号 | 第20页 |
| ·GA 信号转导 | 第20-21页 |
| ·病原信号 | 第21页 |
| ·顶端生长细胞 | 第21-22页 |
| 2. 巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统研究进展 | 第22-27页 |
| ·常用表达菌株及表达载体 | 第22-24页 |
| ·表达菌株 | 第22-23页 |
| ·表达载体 | 第23-24页 |
| ·基因整合及表达调控的机理 | 第24-26页 |
| ·基因整合 | 第24-25页 |
| ·调控机制 | 第25-26页 |
| ·外源基因自身特性对 P. pastoris 表达系统的影响 | 第26-27页 |
| ·外源蛋白的翻译后修饰 | 第27页 |
| 3. GST pull down 方法概述 | 第27-28页 |
| 4. Topo 克隆及 Gateway 亚克隆方法概述 | 第28-29页 |
| 5. 本研究的目的及内容 | 第29-31页 |
| 第二章 利用巴斯德毕赤酵母表达拟南芥异三聚体G 蛋白β和γ亚基 | 第31-50页 |
| 1 前言 | 第31-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-42页 |
| ·材料 | 第32-34页 |
| ·菌种及载体 | 第32页 |
| ·主要试剂和相关溶液的配制 | 第32-34页 |
| ·主要仪器设备 | 第34页 |
| ·方法 | 第34-42页 |
| ·目的基因 AGB1、AGG1 和 AGG2 的克隆 | 第34-35页 |
| ·TA 克隆 PCR 产物 | 第35-37页 |
| ·大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接及转化 | 第36页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第36-37页 |
| ·DNA序列分析 | 第37页 |
| ·TA 克隆产物与表达载体的连接及转化 | 第37页 |
| ·连接重组子的电击转化 | 第37-39页 |
| ·组氨酸缺陷型酵母菌株的筛选 | 第37页 |
| ·甲醇利用正常型酵母菌株的筛选 | 第37-38页 |
| ·GS115 感受态的制备 | 第38页 |
| ·重组子的电击转化 | 第38-39页 |
| ·重组 DNA 的线性化 | 第38页 |
| ·线性化DNA 的去磷酸化及纯化 | 第38-39页 |
| ·线性化 DNA 的电击转化 | 第39页 |
| ·毕赤酵母 GS115 中重组子的鉴定 | 第39-40页 |
| ·毕赤酵母GS115 基因组的提取 | 第39页 |
| ·毕赤酵母GS115 中重组子的鉴定 | 第39-40页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第40页 |
| ·SDS-PAGE 检测目的蛋白 | 第40-41页 |
| ·Bradford 法测蛋白浓度 | 第40-41页 |
| ·SDS-PAGE | 第41页 |
| ·目的蛋白的分离纯化 | 第41-42页 |
| 3. 结果与分析 | 第42-48页 |
| ·PCR 扩增目的基因AGB1、AGG1 和AGG2 | 第42页 |
| ·TA 克隆产物鉴定 | 第42-44页 |
| ·序列比对结果 | 第44页 |
| ·目的基因与表达载体连接产物鉴定 | 第44-45页 |
| ·毕赤酵母 GS115 重组子的鉴定 | 第45-46页 |
| ·目的蛋白的检测 | 第46-48页 |
| 4. 讨论 | 第48-50页 |
| 第三章 AGB1 和RACK1 蛋白对拟南芥种子萌发的作用研究 | 第50-77页 |
| 1. 前言 | 第50页 |
| 2. 材料与方法 | 第50-63页 |
| ·材料 | 第50-53页 |
| ·植物材料 | 第50-51页 |
| ·菌种及载体 | 第51页 |
| ·主要试剂和相关溶液的配制 | 第51-53页 |
| ·主要仪器设备 | 第53页 |
| ·方法 | 第53-63页 |
| ·AGB1 和 RACK1 蛋白对拟南芥种子萌发的影响 | 第53-54页 |
| ·春化作用对拟南芥种子萌发的影响 | 第53-54页 |
| ·不同处理对拟南芥种子萌发的影响 | 第54页 |
| ·利用GST pull down 研究 AGB1 和RACK1 蛋白的相互作用 | 第54-60页 |
| ·目的基因 AGB1、RACK1 的克隆 | 第54-56页 |
| ·TA 克隆PCR 产物 | 第56页 |
| ·大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备(见第二章2.2.2.1) | 第56页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接及转化(见第二章2.2.2.2) | 第56页 |
| ·阳性克隆的筛选(见第二章2.2.2.3) | 第56页 |
| ·DNA 序列分析(操作见第二章2.2.3) | 第56页 |
| ·TA 克隆产物与表达载体的连接及转化(见第二章2.2.4) | 第56页 |
| ·连接重组子的转化到大肠杆菌 BL21 | 第56页 |
| ·大肠杆菌 BL21 感受态细胞的制备(同第二章2.2.2.1) | 第56页 |
| ·连接重组子的转化 | 第56页 |
| ·大肠杆菌 BL21 中重组子的鉴定 | 第56页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第56-58页 |
| ·RACK1 蛋白的诱导表达 | 第56-57页 |
| ·AGB1/GST 融合蛋白的诱导表达 | 第57-58页 |
| ·目的蛋白的分离纯化 | 第58-59页 |
| ·RACK1 蛋白的纯化(操作见第二章2.2.9) | 第58页 |
| ·AGB1/GST 融合蛋白的纯化 | 第58-59页 |
| ·SDS-PAGE 检测目的蛋白(操作见第二章2.2.8) | 第59页 |
| ·RACK1 蛋白与AGB1/GST 融合蛋白的相互作用 | 第59-60页 |
| ·RACK1 蛋白的细胞定位 | 第60-63页 |
| ·RACK1 基因的克隆 | 第60页 |
| ·Topo 克隆 PCR 产物 | 第60-61页 |
| ·Topo 克隆产物的鉴定 | 第61页 |
| ·DNA 序列分析 | 第61页 |
| ·Topo 克隆产物与Gateway 载体的LR 反应及转化 | 第61页 |
| ·LR 反应产物的鉴定 | 第61页 |
| ·重组质粒转化农杆菌GV3101 | 第61-62页 |
| ·农杆菌GV3101 感受态细胞的制备 | 第61-62页 |
| ·重组质粒转化农杆菌GV3101 感受态细胞 | 第62页 |
| ·农杆菌GV3101 重组子的鉴定 | 第62页 |
| ·PEG 介导重组质粒转化拟南芥Col 原生质体 | 第62-63页 |
| ·农杆菌介导重组质粒转化拟南芥 Col 细胞 | 第63页 |
| ·拟南芥 Col 悬浮培养细胞系的建立 | 第63页 |
| ·细胞转化 | 第63页 |
| 3. 结果与分析 | 第63-75页 |
| ·AGB1 和 RACK1 蛋白对拟南芥种子萌发的作用 | 第63-67页 |
| ·春化作用对拟南芥种子萌发的影响 | 第63-64页 |
| ·糖对拟南芥种子萌发的影响 | 第64-65页 |
| ·激素对拟南芥种子萌发的影响 | 第65-67页 |
| ·利用GST pull down 研究 AGB1 和RACK1 蛋白的相互作用 | 第67-72页 |
| ·PCR 扩增目的基因AGB1 和 RACK1 | 第67页 |
| ·TA 克隆产物的鉴定 | 第67-68页 |
| ·序列比对结果 | 第68-69页 |
| ·目的基因与表达载体连接产物鉴定 | 第69-70页 |
| ·大肠杆菌 BL21 重组子的鉴定 | 第70页 |
| ·目的蛋白的检测 | 第70-72页 |
| ·RACK1 蛋白的细胞定位 | 第72-75页 |
| ·PCR 扩增目的基因RACK1 | 第72页 |
| ·Topo 克隆产物的鉴定 | 第72-73页 |
| ·DNA 序列分析(见3.2.3) | 第73页 |
| ·LR 反应产物的鉴定 | 第73页 |
| ·农杆菌 GV3101 重组子的鉴定 | 第73-74页 |
| ·RACK1 蛋白在拟南芥 Col 原生质体中的瞬时表达 | 第74页 |
| ·RACK1 在拟南芥Col 细胞中的定位 | 第74-75页 |
| 4. 讨论 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
