| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-15页 |
| 前言 | 第15-20页 |
| 第一部分 PS1TP5的基因克隆与原核表达 | 第20-36页 |
| 一、材料与方法 | 第20-29页 |
| 1.材料 | 第20-21页 |
| ·细胞株与菌株 | 第20页 |
| ·质粒 | 第20页 |
| ·试剂 | 第20-21页 |
| ·引物合成及DNA测序 | 第21页 |
| 2.方法 | 第21-29页 |
| ·引物设计 | 第21页 |
| ·RT-PCR方法扩增PS1TP5基因 | 第21-23页 |
| ·提取HepG2细胞总RNA | 第21页 |
| ·RT-PCR | 第21-23页 |
| ·回收PS1TP5基因片段 | 第23页 |
| ·构建pET-32a(+)-PS1TP5原核表达质粒 | 第23-27页 |
| ·连接构建pGEM-T-PS1TP5克隆载体 | 第23-25页 |
| ·连接构建pET-32a(+)-PS1TP5表达载体 | 第25-27页 |
| ·PS1TP5重组蛋白的诱导表达 | 第27-29页 |
| ·SDS-PAGE | 第27-28页 |
| ·Western Blotting检测PS1TP5 | 第28-29页 |
| 二、结果 | 第29-34页 |
| 1.RT-PCR方法扩增PS1TP5基因 | 第29-30页 |
| 2.pGEM-T-PS1TP5阳性转化子的菌液PCR筛选与双酶切鉴定 | 第30-32页 |
| 3.pET-32a(+)-PS1TP5阳性转化子的菌落PCR筛选与双酶切鉴定 | 第32-33页 |
| 4.PS1TP5重组蛋白的表达与Western blotting检测 | 第33-34页 |
| 三、讨论 | 第34-36页 |
| 第二部分 PS1TP5的部分功能研究 | 第36-77页 |
| 第一节 PS1TP5的理化性质与结构功能预测分析 | 第36-39页 |
| 一、方法 | 第36-37页 |
| 二、结果 | 第37-38页 |
| 三、讨论 | 第38-39页 |
| 第二节 PS1TP5相互作用蛋白的筛选分析 | 第39-57页 |
| 一、材料与方法 | 第39-47页 |
| 1.材料 | 第39-40页 |
| ·菌株 | 第39页 |
| ·载体 | 第39页 |
| ·试剂 | 第39页 |
| ·引物合成及DNA序列测定 | 第39-40页 |
| 2.方法 | 第40-47页 |
| ·引物设计 | 第40页 |
| ·RT-PCR方法扩增PS1TP5基因 | 第40页 |
| ·构建pGBKT7-PS1TP5酵母细胞表达质粒 | 第40-41页 |
| ·连接构建pGEM-T-PS1TP5克隆载体 | 第40页 |
| ·连接构建pGBKT7-PS1TP5表达载体 | 第40-41页 |
| ·pGBKT7-PS1TP5转化AH109酵母细胞 | 第41-42页 |
| ·PS1TP5在AH109酵母细胞中的表达 | 第42-44页 |
| ·提取酵母细胞总蛋白 | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE及Western Blotting检测PS1TP5表达 | 第43-44页 |
| ·酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库中与PS1TP5相互作用蛋白 | 第44-47页 |
| ·酵母双杂交筛选 | 第44-45页 |
| ·酵母质粒电转化大肠埃希菌 | 第45-47页 |
| 二、结果 | 第47-55页 |
| 1.RT-PCR方法扩增PS1TP5基因 | 第47页 |
| 2.pGEM-T-PS1TP5阳性转化子的菌液PCR筛选与双酶切鉴定 | 第47-48页 |
| 3.pGBKT7-PS1TP5阳性转化子的菌落PCR筛选与双酶切鉴定 | 第48-49页 |
| 4.pGBKT7-PS1TP5阳性转化酵母的菌落PCR筛选 | 第49-50页 |
| 5.酵母细胞蛋白的Western Blotting检测 | 第50-51页 |
| 6.酵母双杂交筛选阳性文库质粒 | 第51-52页 |
| 7.阳性文库质粒的酶切鉴定 | 第52-55页 |
| 三、讨论 | 第55-57页 |
| 第三节 PS1TP5反式调节基因的筛选分析 | 第57-77页 |
| 一、材料与方法 | 第57-68页 |
| 1.材料 | 第57页 |
| ·菌株 | 第57页 |
| ·质粒 | 第57页 |
| ·试剂 | 第57页 |
| ·引物合成及DNA序列测定 | 第57页 |
| 2.方法 | 第57-68页 |
| ·构建pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5真核表达质粒 | 第57-58页 |
| ·pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5转染细胞 | 第58-60页 |
| ·磁珠法提取pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5及pcDNA3.1/myc-His(-)A空载体转染级质粒 | 第58-60页 |
| ·pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5及pcDNA3.1/myc-His(-)A空载体转染HepG2细胞 | 第60页 |
| ·抑制性消减杂交技术筛选PSlTP5反式调节基因 | 第60-68页 |
| ·提取转染细胞mRNA | 第60-61页 |
| ·合成双链cDNA(dscDNA) | 第61-62页 |
| ·消减杂交文库的建立 | 第62-67页 |
| ·PCR产物的克隆、鉴定及分析 | 第67-68页 |
| 二、结果 | 第68-74页 |
| 1.pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5阳性克隆菌落PCR筛选与双酶切鉴定 | 第68-70页 |
| 2.mRNA的定性定量分析 | 第70页 |
| 3.接头连接效率的检测 | 第70-71页 |
| 4.cDNA消减文库消减效率的鉴定 | 第71-72页 |
| 5.差异表达cDNA片段的鉴定 | 第72-73页 |
| 6.DNA测序及同源性分析 | 第73-74页 |
| 三、讨论 | 第74-77页 |
| 结论 | 第77页 |
| 进一步需要研究的问题 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-86页 |
| 攻读学位期间主要研究成果 | 第86-92页 |
| 攻读学位期间已发表及待发表论文 | 第92-94页 |
| 致谢 | 第94页 |
