| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-50页 |
| 第一章 杆状病毒的分子生物学性质 | 第14-24页 |
| 1 杆状病毒生活史 | 第14-18页 |
| ·杆状病毒的分类地位 | 第14-15页 |
| ·NPV的病毒形态和生活史 | 第15-18页 |
| 2 BmNPV基因组结构分析 | 第18-21页 |
| 3 总结 | 第21页 |
| 参考文献 | 第21-24页 |
| 第二章 昆虫杆状病毒表达载体系统 | 第24-40页 |
| 1 杆状病毒表达系统的优缺点 | 第24-25页 |
| 2 启动子的选择 | 第25-26页 |
| ·polh启动子 | 第25-26页 |
| ·p10启动子 | 第26页 |
| ·ie-1启动子 | 第26页 |
| 3 重组杆状病毒的构建和筛选方法 | 第26-32页 |
| ·传统的重组病毒构建方法和空斑分析 | 第26-28页 |
| ·病毒线性化技术 | 第28-29页 |
| ·大肠杆菌—昆虫细胞穿梭载体(Bac-to-Bac系统)技术 | 第29-32页 |
| 4 外源基因在昆虫细胞内的表达 | 第32-36页 |
| ·昆虫细胞的无血清培养 | 第32-34页 |
| ·蛋白水解产物有望代替血清 | 第33页 |
| ·蛋白水解产物的特殊作用 | 第33-34页 |
| ·有关昆虫生长因子的利用 | 第34页 |
| ·细胞培养中的蛋白酶水解问题 | 第34-36页 |
| ·杆状病毒编码的蛋白酶 | 第35页 |
| ·BEVS中蛋白质水解的控制 | 第35-36页 |
| 5 在幼虫和蛹体内表达外源基因产物 | 第36页 |
| 6 总结 | 第36-37页 |
| 参考文献 | 第37-40页 |
| 第三章 杆状病毒表达系统的应用 | 第40-47页 |
| 1 用于基础研究 | 第40-41页 |
| 2 药物开发和疫苗研究 | 第41-42页 |
| 3 杆状病毒表达载体在哺乳动物基因治疗上的应用 | 第42-43页 |
| ·杆状病毒介导的体外基因表达 | 第42-43页 |
| ·杆状病毒介导的体内基因转导的障碍和克服措施 | 第43页 |
| 4 昆虫杆状病毒作为生物杀虫剂的应用 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-47页 |
| 第四章 课题研究背景及总体试验设计 | 第47-50页 |
| 第二部分 试验研究 | 第50-97页 |
| 第一章 家蚕BmNPV Bac-to-Bac快速表达系统的构建 | 第50-67页 |
| 1 材料和方法 | 第52-59页 |
| ·实验材料 | 第52页 |
| ·试剂、实验动物及细胞 | 第52-53页 |
| ·从细菌中抽提大质粒DNA(大于100kb)的方法 | 第53-54页 |
| ·杆状病毒基因组提取 | 第54页 |
| ·热击转化和电转化感受态细胞的制备 | 第54-55页 |
| ·热击转化感受态细胞的制备 | 第54页 |
| ·电转化感受态细胞的制备 | 第54-55页 |
| ·转移载体的构建 | 第55-56页 |
| ·AcNPV Bacmid DNA中8.6kb基因片段和BmNPV多角体启动子左右侧翼基因序列的克隆的克隆 | 第55-56页 |
| ·构建转移载体 | 第56页 |
| ·共转染 | 第56页 |
| ·重组病毒的筛选 | 第56-57页 |
| ·供体质粒的改进 | 第57-59页 |
| 2 结果 | 第59-63页 |
| ·转移载体的构建 | 第59-60页 |
| ·BmNPV bacmid的构建、筛选和鉴定 | 第60-62页 |
| ·分泌型供体质粒的构建 | 第62页 |
| ·BmNPV Bac-to-Bac表达系统的构建 | 第62-63页 |
| 3 讨论 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-67页 |
| 第二章 BmNPV Bac-to-Bac(polh~+)快速表达系统的构建 | 第67-75页 |
| 1 材料和方法 | 第68-71页 |
| ·实验材料 | 第68页 |
| ·试剂 | 第68-69页 |
| ·细胞 | 第69页 |
| ·转移载体的构建 | 第69-70页 |
| ·Bmbacmid(polh~+)的构建 | 第70-71页 |
| 2 结果与讨论 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-75页 |
| 第三章 提高家蚕幼虫生物反应器表达效率的研究 | 第75-84页 |
| 1 材料和方法 | 第76-79页 |
| ·实验材料 | 第76页 |
| ·试剂 | 第76-77页 |
| ·实验动物及细胞 | 第77页 |
| ·Bmbacmid中半胱氨酸蛋白酶基因的删除 | 第77-78页 |
| ·含目的基因的重组杂交病毒的构建 | 第78页 |
| ·重组蛋白质的表达和纯化 | 第78-79页 |
| ·Hybacmid的构建 | 第79页 |
| 2 结果与讨论 | 第79-82页 |
| ·半胱氨酸蛋白酶基因的删除 | 第79-80页 |
| ·删除半胱氨酸蛋白酶提高重组蛋白生产效率 | 第80-81页 |
| ·Hybacmid表达载体的构建 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-84页 |
| 第四章 BmNPV Bac-to-Bac表达系统的应用研究 | 第84-96页 |
| 1 材料和方法 | 第85-90页 |
| ·实验材料 | 第85页 |
| ·试剂 | 第85页 |
| ·实验动物及细胞 | 第85页 |
| ·构建重组病毒 | 第85-88页 |
| ·重组供体质粒的构建 | 第85-86页 |
| ·转化转座 | 第86页 |
| ·抽提大分子DNA及重组病毒的鉴定 | 第86-87页 |
| ·转染BmN培养细胞 | 第87页 |
| ·收获并保存重组杆状病毒 | 第87-88页 |
| ·重组蛋白鉴定 | 第88页 |
| ·家蚕幼虫中生产和纯化重组VEGF165 | 第88-89页 |
| ·样品收集 | 第88页 |
| ·蛋白质纯化 | 第88-89页 |
| ·重组VEGF的生物活性分析 | 第89-90页 |
| 2 结果 | 第90-92页 |
| ·重组病毒的构建和蛋白质表达 | 第90-91页 |
| ·纯化重组VEGF | 第91页 |
| ·重组VEGF能够促进细胞生长 | 第91-92页 |
| 3 讨论 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-96页 |
| 研究总结与展望 | 第96-97页 |
| 附录A 本论文内应用的质粒图谱 | 第97-101页 |
| 附录B 本研究用缓冲液和培养基配方 | 第101-106页 |
| 致谢 | 第106-108页 |
| 攻读硕博期间发表的论文 | 第108-109页 |
