| 第一章 前言 | 第1-63页 |
| 第一节 极端微生物及嗜热古菌简介 | 第9-15页 |
| 第二节 酯酶简介 | 第15-19页 |
| 1. 酯酶及其分类 | 第15-18页 |
| 2. 酯酶的应用 | 第18-19页 |
| 第三节 脯氨酸寡肽酶简介 | 第19-24页 |
| 1. 生理活性 | 第20页 |
| 2. 结构特征 | 第20-21页 |
| 3. 活性中心 | 第21-23页 |
| 4. 底物选择性 | 第23页 |
| 5. 动力学特征 | 第23-24页 |
| 第四节 酰基氨酰肽酶简介 | 第24-28页 |
| 1. 酰基氨酰肽酶研究简介 | 第24-26页 |
| 2. 催化机制 | 第26-28页 |
| (1) 催化三联体与过渡态 | 第26-27页 |
| (2) 稳定过渡态的氧阴离子穴 | 第27-28页 |
| 第五节 酶的理性设计与非理性设计 | 第28-45页 |
| 1. 蛋白质的理性设计 | 第29-31页 |
| 2. 酶的定向进化 | 第31-38页 |
| (1) 定向进化的原理及目的 | 第31-33页 |
| (2) 定向进化中突变文库的构建方法 | 第33-35页 |
| (3) 突变基因的筛选和选择 | 第35-36页 |
| (4) 酶的定向进化的应用 | 第36-38页 |
| 3. 蛋白质工程改造脂肪酶 | 第38-40页 |
| 4. 蛋白质工程改造蛋白酶 | 第40-42页 |
| 5. 蛋白质的半合理设计 | 第42-45页 |
| (1) 基于结构的有选择的随机突变 | 第43-44页 |
| (2) 随机突变后的定点饱和突变 | 第44页 |
| (3) 随机突变与定点饱和突变同步 | 第44-45页 |
| (4) 计算机辅助的半合理设计 | 第45页 |
| 第六节 本论文立题依据 | 第45-48页 |
| 参考文献 | 第48-63页 |
| 第二章 定向进化提高APE1547 的酯酶活力 | 第63-91页 |
| 第一节 序言 | 第63页 |
| 第二节 实验材料 | 第63-66页 |
| 1. 质粒和菌种 | 第63-64页 |
| 2. 试剂 | 第64页 |
| 3. 仪器 | 第64页 |
| 4. 溶液配置 | 第64-66页 |
| 第三节 实验方法 | 第66-75页 |
| 1. 野生单克隆库的构建及酯酶活力的测定 | 第66页 |
| 2. 筛选方法灵敏性的统计学分析 | 第66-67页 |
| 3. 随机突变库的构建与筛选 | 第67-72页 |
| (1) 目的基因的制备 | 第67-68页 |
| (2) 载体的制备 | 第68页 |
| (3) 目的基因与载体的连接 | 第68-69页 |
| (4) 突变库的构建 | 第69-70页 |
| (5) 随机突变库的筛选 | 第70-72页 |
| 4. 野生型与阳性突变体的纯化 | 第72-73页 |
| 5. 酯酶活力的测定 | 第73-74页 |
| 6. 核酸序列测定 | 第74页 |
| 7. 酶学性质表征 | 第74-75页 |
| (1) 最适温度的测定 | 第74页 |
| (2) 热稳定性测定 | 第74-75页 |
| (3) 最适pH 和催化基团解离常数的测定 | 第75页 |
| (4) 突变位点结构分析 | 第75页 |
| 第四节 实验结果 | 第75-84页 |
| 1. 酶标板筛选灵敏性的统计学分析 | 第75-76页 |
| 2. 随机突变库的构建 | 第76-78页 |
| (1) Error-Prone PCR 模板制备 | 第76-77页 |
| (2) Error-Prone PCR | 第77-78页 |
| (3) 随机突变库的随机突变率评估 | 第78页 |
| 3. 进化突变体的获得 | 第78-80页 |
| (1) 突变库的筛选、阳性突变体纯化和活力测定 | 第78-79页 |
| (2) 野生型和突变体肽酶/酯酶活力比较 | 第79-80页 |
| 4. 野生型和阳性突变体酶学性质的表征 | 第80-84页 |
| (1) 突变体的热稳定性 | 第81页 |
| (2) 温度对野生型和突变体催化活力的影响 | 第81-82页 |
| (3) pH 对野生型和突变体活力影响和催化残基解离常数的测定 | 第82-84页 |
| 第五节 讨论 | 第84-87页 |
| 第六节 小结 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-91页 |
| 第三章 理性设计提高APE1547 酯酶活力 | 第91-129页 |
| 第一节 序言 | 第91-92页 |
| 第二节 实验材料 | 第92-93页 |
| 1. 菌种和质粒 | 第92页 |
| 2. 试剂 | 第92页 |
| 3. 仪器 | 第92页 |
| 4. 溶液配置 | 第92-93页 |
| 第三节 实验方法 | 第93-99页 |
| 1. 同源序列比对 | 第93页 |
| 2. 三级结构比对 | 第93-94页 |
| 3. 改进的全质粒PCR(定点饱和突变) | 第94-95页 |
| 4. 蛋白质纯化和米氏常数测定 | 第95页 |
| 5. 限速步骤的确定 | 第95-96页 |
| 6. 分步速率与对应活化能的计算 | 第96-97页 |
| 7. 模型构建 | 第97-99页 |
| 第四节 实验结果 | 第99-122页 |
| 1. 序列和结构同源性比对 | 第99-102页 |
| 2. R526 位点的饱和突变 | 第102-103页 |
| 3. 突变体的纯化及突变体的动力学分析 | 第103-107页 |
| 4. 突变体和野生型分步速率与对应活化能 | 第107-111页 |
| 5. 酶与底物复合物计算机模建及分子动力学模拟 | 第111-122页 |
| 第五节 讨论 | 第122-124页 |
| 第六节 小结 | 第124-126页 |
| 参考文献 | 第126-129页 |
| 论文创新点 | 第129-132页 |
| 作者简历 | 第132-134页 |
| 中文摘要 | 第134-140页 |
| Abstract | 第140-148页 |
| 致谢 | 第148页 |