| 缩略词表 | 第1-8页 |
| 第一部分 Spindlin1蛋白结构的解析 | 第8-44页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 前言 | 第10-12页 |
| 一、Spindlin1的原核表达 | 第12-21页 |
| (一) 材料 | 第12-14页 |
| 1、质粒与菌株 | 第12页 |
| 2、引物序列 | 第12页 |
| 3、工具酶与DNA分子量标准 | 第12页 |
| 4、试剂盒 | 第12页 |
| 5、主要试剂 | 第12页 |
| 6、主要仪器 | 第12-13页 |
| 7、常用溶液 | 第13-14页 |
| 8、互联网资源 | 第14页 |
| (二) 方法 | 第14-18页 |
| 1、引物设计及PCR反应 | 第14-15页 |
| 2、PCR产物的纯化 | 第15页 |
| 3、目的片断与pGEX-2T载体的连接 | 第15-16页 |
| 4、感受态细菌的制备 | 第16页 |
| 5、连接产物的转化 | 第16页 |
| 6、质粒小量提取 | 第16页 |
| 7、转化子鉴定 | 第16-17页 |
| 8、测序 | 第17页 |
| 9、原核表达 | 第17页 |
| 10、蛋白电泳 | 第17页 |
| 11、染色与脱色 | 第17-18页 |
| 12、原核表达条件的优化及表达形式分析 | 第18页 |
| (三) 结果 | 第18-21页 |
| 二、重组Spindlin1蛋白的纯化 | 第21-26页 |
| (一) 材料 | 第21-22页 |
| 1、主要仪器 | 第21页 |
| 2、常用溶液 | 第21-22页 |
| 3、互联网资源 | 第22页 |
| (二) 方法 | 第22-23页 |
| 1、低温诱导表达 | 第22页 |
| 2、破菌 | 第22页 |
| 3、亲和纯化 | 第22页 |
| 4、蛋白质理化性质分析 | 第22页 |
| 5、离子交换色谱纯化 | 第22页 |
| 6、蛋白浓缩、浓度测定 | 第22-23页 |
| (三) 结果 | 第23-26页 |
| 三、重组Spindlin1蛋白的结晶与解构 | 第26-33页 |
| (一) 重组Spindlin1发蛋白的结晶 | 第26页 |
| 1、常用试剂 | 第26页 |
| 2、结晶方法 | 第26页 |
| (二) 晶体质量评估 | 第26-27页 |
| (三) 优化结晶条件 | 第27页 |
| (四) 重组Spindlin1蛋白晶体的重原子浸泡 | 第27-28页 |
| (五) 重组Spindlin1蛋白晶体的结构解析 | 第28页 |
| 1、工具软件 | 第28页 |
| 2、数据库 | 第28页 |
| (六) 结果 | 第28-33页 |
| 四、突变实验 | 第33-39页 |
| (一) 材料 | 第33-34页 |
| (二) 方法 | 第34-37页 |
| (三) 结果 | 第37-39页 |
| 讨论 | 第39-41页 |
| 结论 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-44页 |
| 第二部分 Spindlin1相互作用蛋白的寻找与确认 | 第44-77页 |
| 摘要 | 第44-45页 |
| Abstract | 第45-46页 |
| 前言 | 第46-47页 |
| 一、多克隆抗体制备 | 第47-49页 |
| 二、多克隆抗体鉴定 | 第49-52页 |
| 三、epitope tagging | 第52-55页 |
| 四、GST pulldown | 第55-59页 |
| (一) 材料 | 第55页 |
| (二) 方法 | 第55-57页 |
| (三) 结果 | 第57-59页 |
| 五、质谱检测与数据库查询 | 第59-62页 |
| (一) 仪器 | 第59页 |
| (二) 数据库 | 第59页 |
| (三) 结果 | 第59-62页 |
| 六、蛋白相互作用的确认 | 第62-69页 |
| (一) 基因克隆与载体构建 | 第62-64页 |
| (二) GST pulldown | 第64-66页 |
| (三) 动态光散射 | 第66页 |
| (四) 交联电泳 | 第66-67页 |
| (五) 免疫共沉淀验证蛋白相互作用 | 第67-69页 |
| 讨论 | 第69-73页 |
| 结论 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 博士期间撰写的论著 | 第77页 |