| 致谢 | 第1-10页 |
| 中文摘要 | 第10-11页 |
| 缩略语 | 第11-12页 |
| 第一部分 文献综述与实验设计方案 | 第12-43页 |
| 第一章 瘦素研究进展 | 第13-30页 |
| 1 瘦素的发现 | 第13-14页 |
| 2 瘦素基因 | 第14-15页 |
| 3 瘦素的结构及分布 | 第15-17页 |
| ·瘦素的一级结构 | 第15-16页 |
| ·瘦素的二级结构 | 第16页 |
| ·瘦素的三级结构 | 第16-17页 |
| ·瘦素的分布及影响因素 | 第17页 |
| 4 瘦素受体 | 第17-19页 |
| ·瘦素受体基因 | 第17-18页 |
| ·瘦素受体结构及分布 | 第18-19页 |
| 5 瘦素的生物学功能 | 第19-23页 |
| ·瘦素对于脂肪组织的作用 | 第19页 |
| ·瘦素对葡萄糖代谢的作用 | 第19-20页 |
| ·瘦素对胰岛及胰岛素的作用 | 第20页 |
| ·瘦素与女性青春期发育 | 第20-21页 |
| ·瘦素与生殖 | 第21-22页 |
| ·瘦素与血管系统代谢及心脑血管疾病的关系 | 第22页 |
| ·瘦素与免疫 | 第22-23页 |
| ·瘦素与免疫细胞的增殖 | 第22-23页 |
| ·瘦素与免疫细胞激活 | 第23页 |
| 6 瘦素的作用机制 | 第23-26页 |
| ·瘦素调节脂肪与能量代谢的作用机制 | 第23-24页 |
| ·瘦素通过中枢神经系统以及外周发挥作用 | 第24页 |
| ·瘦素的信号转导 | 第24-26页 |
| 7 基因突变小鼠与瘦素研究 | 第26-28页 |
| ·基因自然突变动物 | 第26页 |
| ·基因工程修饰动物与瘦素 | 第26-28页 |
| 8 瘦素在临床研究中的作用 | 第28-29页 |
| ·瘦素的预警作用 | 第28页 |
| ·用重组瘦素进行肥胖治疗 | 第28页 |
| ·用重组人瘦素治疗糖尿病患者 | 第28-29页 |
| 9 瘦素研究展望 | 第29-30页 |
| 第二章 大肠杆菌表达系统 | 第30-40页 |
| 1 基因工程的开端 | 第30页 |
| 2 大肠杆菌表达系统的基本原理 | 第30-31页 |
| 3 大肠杆菌表达系统基因表达与调控 | 第31-33页 |
| ·原核基因表达的基本元件 | 第31页 |
| ·真核基因在大肠杆菌体系中表达的条件 | 第31-33页 |
| ·启动子的选择 | 第32-33页 |
| ·核糖体结合位点 | 第33页 |
| 4 真核基因在大肠杆菌中产生融合蛋白 | 第33-34页 |
| ·融合基因-融合蛋白 | 第33页 |
| ·非融合基因-非融合蛋白 | 第33-34页 |
| ·融合基因-非融合蛋白 | 第34页 |
| 5 大肠杆菌表达载体的类型及应用 | 第34-35页 |
| ·非融合表达载体 | 第34页 |
| ·融合表达载体 | 第34-35页 |
| ·表面呈现表达载体 | 第35页 |
| 6 基因在大肠杆菌中的高效表达 | 第35-36页 |
| 7 包含体的变性与复性 | 第36-39页 |
| ·包涵体的定义及形成原因 | 第36页 |
| ·包涵体的提取、洗涤、溶解 | 第36-37页 |
| ·包涵体的提取 | 第36-37页 |
| ·包涵体的洗涤 | 第37页 |
| ·包涵体的溶解 | 第37页 |
| ·包涵体的复性 | 第37-38页 |
| ·稀释复性 | 第37页 |
| ·透析复性 | 第37-38页 |
| ·超滤复性 | 第38页 |
| ·柱上复性 | 第38页 |
| ·高蛋白质浓度下的复性 | 第38页 |
| ·包涵体蛋白复性效率 | 第38-39页 |
| 8 研究展望 | 第39-40页 |
| 第三章 实验设计方案 | 第40-43页 |
| ·本实验的目的和意义 | 第40-43页 |
| ·实验流程图 | 第41-42页 |
| ·本研究所要解决的关键问题 | 第42-43页 |
| 第二部分 研究内容 | 第43-79页 |
| 第四章 重组表达载体pET-28a-lep的构建 | 第44-61页 |
| ·材料和试剂 | 第44-47页 |
| ·实验方法 | 第47-52页 |
| ·酶切位点设计 | 第47页 |
| ·以质粒pMET-mouse leptin-His为模板PCR扩增目的片段 | 第47-48页 |
| ·低熔点胶回收、纯化PCR产物 | 第48页 |
| ·PCR产物酶切 | 第48页 |
| ·酶切PCR产物热失活 | 第48-49页 |
| ·载体pET-28a(+)酶切 | 第49页 |
| ·低溶点胶回收目的片段 | 第49页 |
| ·连接反应 | 第49-50页 |
| ·E.coli TG1感受态细胞的制备 | 第50页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第50页 |
| ·碱法小量抽提质粒DNA | 第50-51页 |
| ·核酸电泳 | 第51页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第51-52页 |
| ·PCR鉴定 | 第51-52页 |
| ·酶切鉴定 | 第52页 |
| ·pET-28a-lep基因序列测定 | 第52页 |
| ·结果与讨论 | 第52-61页 |
| ·酶切位点的设计 | 第52-56页 |
| ·重组表达载体pET-28a-lep的构建 | 第56-59页 |
| ·PCR反应鉴定结果 | 第56-57页 |
| ·表达载体pET-28a(+)的图谱 | 第57-58页 |
| ·重组表达载体pET-28a-lep的构建策略 | 第58-59页 |
| ·重组表达载体pET-28a-lep的鉴定 | 第59-60页 |
| ·重组表达载体pET-28a-lep测序结果 | 第60页 |
| ·讨论 | 第60-61页 |
| 第五章 基因工程表达菌株BL21-pET28-lep的构建以及诱导表达 | 第61-67页 |
| ·试剂和材料 | 第61-63页 |
| ·实验方法 | 第63-65页 |
| ·E.coli BL21冻存甘油菌的复苏、传代 | 第63页 |
| ·E.coli BL21感受态细胞的制备 | 第63页 |
| ·重组表达载体pET-28a-lep转化E.coli BL21感受态细胞 | 第63页 |
| ·工程菌株BL21-pET28-lep在不同时间的诱导表达 | 第63页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第63-64页 |
| ·SDS-PAGE考马斯亮蓝凝胶染色与脱色 | 第64页 |
| ·工程菌株BL21-pET28-lep的保存 | 第64页 |
| ·采用薄层色谱确定最高表达量 | 第64-65页 |
| ·结果与讨论 | 第65-67页 |
| ·SDS-PAGE | 第65-66页 |
| ·薄层色谱分析结果 | 第66页 |
| ·讨论 | 第66-67页 |
| 第六章 包涵体的变性与复性 | 第67-70页 |
| ·材料与试剂 | 第67页 |
| ·实验方法 | 第67-69页 |
| ·包涵体的提取 | 第67-68页 |
| ·包涵体的变性、复性处理及可溶性检测 | 第68-69页 |
| ·结果与讨论 | 第69-70页 |
| 第七章 融合蛋白的纯化 | 第70-75页 |
| ·材料与试剂 | 第70页 |
| ·实验方法 | 第70-72页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第70-71页 |
| ·Ni~(2+)亲和交换柱的再生处理 | 第71页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第71-72页 |
| ·结果与讨论 | 第72-75页 |
| ·台式记录仪记录的洗脱结果 | 第72-73页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第73-74页 |
| ·蛋白含量检测 | 第74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| 第八章 western blotting鉴定 | 第75-78页 |
| ·材料和试剂 | 第75页 |
| ·实验方法 | 第75-77页 |
| ·结果与讨论 | 第77-78页 |
| 第九章 结论 | 第78-79页 |
| 英文摘要 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-87页 |
| 附录1 原核表达质粒pET-28a-lep所插入的mouse leptin基因测序结果 | 第87-88页 |
| 附录2 攻读硕士期间发表的论文 | 第88-90页 |
