肠道病毒71型VP1-VP4在重组腺病毒系统中的表达及免疫学评价
| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-14页 |
| 一、实验材料 | 第14-17页 |
| (一) 菌株及载体 | 第14页 |
| (二) 病毒及细胞 | 第14-15页 |
| (三) 主要试剂 | 第15-16页 |
| (四) 主要仪器 | 第16-17页 |
| (五) 实验动物 | 第17页 |
| 二、实验方法 | 第17-31页 |
| (一) 引物设计及合成 | 第17-18页 |
| 1. EV71特异性检测引物合成 | 第17页 |
| 2. 基因的克隆合成 | 第17-18页 |
| (二) 毒株的分离、传代及滴度检测 | 第18-19页 |
| 1. EV71原代分离 | 第18页 |
| 2. EV71病毒的扩增及滴度检测 | 第18-19页 |
| (三) 毒株的鉴定 | 第19-20页 |
| 1. 形态学检测 | 第19页 |
| 2. 血清中和实验 | 第19-20页 |
| 3. 异核酸片段的鉴定 | 第20页 |
| (四) 目的基因的克隆及穿梭质粒的构建 | 第20-23页 |
| 1. 目的基因的克隆 | 第20-21页 |
| 2. 双顺反子的构建 | 第21-22页 |
| 3. 穿梭质粒构建 | 第22-23页 |
| (五) 重组腺病毒质粒的构建 | 第23-25页 |
| 1. 重组穿梭质粒的线性化及去磷酸化 | 第23页 |
| 2. 穿梭质粒与复制缺陷型腺病毒载体的重组 | 第23页 |
| 3. 阳性重组腺病毒质粒的大量扩增 | 第23-25页 |
| (六) 重组腺病毒的包装 | 第25-26页 |
| 1. 重组腺病毒转染293细胞 | 第25页 |
| 2. 重组腺病毒收获,传代 | 第25页 |
| 3. 重组腺病毒滴度检测 | 第25-26页 |
| 4. 重组腺病毒蔗糖垫浓缩 | 第26页 |
| (七) 目的基因表达的检测 | 第26-28页 |
| 1. RT-PCR检测 | 第26-27页 |
| 2. 免疫荧光检测 | 第27页 |
| 3. 免疫细胞组化检测 | 第27-28页 |
| (八) 实验动物免疫 | 第28-31页 |
| 1. EV71特异血清获得 | 第28-29页 |
| 2. 重组腺病毒免疫BALB/C小鼠 | 第29-31页 |
| 三、实验结果及分析 | 第31-46页 |
| (一) 分离毒株在Vero细胞上的生长特性 | 第31页 |
| (二) 分离毒株的特异性 | 第31-33页 |
| 1. 血清中和试验 | 第32页 |
| 2. EV71特异性基因片段鉴定 | 第32-33页 |
| 3. EV71形态学观察 | 第33页 |
| (三) EV71病毒滴度检测 | 第33-34页 |
| (四) EV71特异血清效价检测结果 | 第34页 |
| (五) 目的基因的克隆 | 第34-35页 |
| (六) 穿梭质粒的鉴定 | 第35-36页 |
| (七) 重组腺病毒质粒的鉴定 | 第36页 |
| (八) 重组腺病毒的获得 | 第36-37页 |
| (九) 重组腺病毒形态学观察 | 第37-38页 |
| (十) 重组腺病毒中目的基因的表达 | 第38-42页 |
| 1. 目的基因mRNA的转录水平 | 第38-40页 |
| 2. 免疫荧光检测目的蛋白的表达 | 第40-41页 |
| 3. 免疫细胞组化检测目的蛋白的表达 | 第41-42页 |
| (十一) 重组腺病毒免疫原性及抗原性检测 | 第42-46页 |
| 四、讨论 | 第46-49页 |
| (一) 表达系统的选择 | 第47页 |
| (二) 目的基因的克隆 | 第47-48页 |
| (三) 重组腺病毒的包装 | 第48页 |
| (四) 重组腺病毒滴度与代次关系 | 第48页 |
| (五) 重组腺病毒中外源目的基因的转录和表达 | 第48-49页 |
| (六) 免疫原性的鉴定 | 第49页 |
| 五、小结 | 第49-50页 |
| 六、展望 | 第50-52页 |
| 论文参考文献 | 第52-57页 |
| 论文综述 | 第57-66页 |
| 附录 | 第66-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 研究生简历 | 第87页 |
| 研究生在读期间已发表的文章 | 第87-88页 |
