| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 综述一 布鲁氏菌研究进展 | 第16-40页 |
| 1 布鲁氏菌概述 | 第17-22页 |
| 1.1 布鲁氏菌的病原学特征 | 第17-20页 |
| 1.2 布鲁氏菌的分类 | 第20-21页 |
| 1.3 布鲁氏菌病的流行与传播 | 第21-22页 |
| 2 布鲁氏菌病的疫苗 | 第22-24页 |
| 2.1 减毒活疫苗 | 第22-23页 |
| 2.2 基因工程疫苗 | 第23-24页 |
| 3 布鲁氏菌病的诊断与防治 | 第24-25页 |
| 3.1 细菌学诊断 | 第24页 |
| 3.2 血清学诊断 | 第24-25页 |
| 3.3 分子生物学诊断 | 第25页 |
| 3.4 布鲁氏菌病的防治 | 第25页 |
| 4 布鲁氏菌的研究进展 | 第25-40页 |
| 4.1 基因组学研究进展 | 第25-27页 |
| 4.2 外膜蛋白研究进展 | 第27-29页 |
| 4.3 分泌系统研究进展 | 第29页 |
| 4.4 布鲁氏菌脂多糖研究进展 | 第29-36页 |
| 4.5 布鲁氏菌脂多糖与机体天然免疫 | 第36-40页 |
| 综述二 细胞自噬研究进展 | 第40-56页 |
| 1 细胞自噬概述 | 第40-43页 |
| 2 自噬相关调控基因 | 第43-46页 |
| 3 自噬的检测方法 | 第46-48页 |
| 4 布鲁氏菌与细胞自噬 | 第48-50页 |
| 5 microRNA(miRNA)与细胞自噬 | 第50-52页 |
| 6 自噬与疾病 | 第52-56页 |
| 1 引言 | 第56-57页 |
| 2 技术路线 | 第57-58页 |
| 第一部分 B.melitensis M5-90疫苗株per基因缺失株的构建 | 第58-80页 |
| 前言 | 第58页 |
| 1 材料与方法 | 第58-70页 |
| 1.1 实验材料 | 第58-61页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第58-59页 |
| 1.1.2 引物 | 第59页 |
| 1.1.3 试剂 | 第59页 |
| 1.1.4 实验仪器 | 第59-60页 |
| 1.1.5 主要溶液配制方法 | 第60-61页 |
| 1.2 实验方法 | 第61-70页 |
| 1.2.1 同源重组质粒pGEM-△per的构建 | 第61-69页 |
| 1.2.1.1 B.melitensis M5-90疫苗株基因组的提取 | 第61-62页 |
| 1.2.1.2 per基因左、右同源臂(C端、N端)和卡那霉素抗性基因的扩增 | 第62-63页 |
| 1.2.1.3 PCR扩增产物的回收 | 第63页 |
| 1.2.1.4 回收产物与pMD20-T载体连接 | 第63页 |
| 1.2.1.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第63-64页 |
| 1.2.1.6 连接产物的转化 | 第64页 |
| 1.2.1.7 筛选阳性克隆并测序 | 第64-65页 |
| 1.2.1.8 同源重组质粒pGEM-△per的构建与鉴定 | 第65-69页 |
| 1.2.2 缺失株M5-90-△per的构建 | 第69-70页 |
| 1.2.2.1 制备B.melitensis M5-90疫苗株感受态细胞 | 第69页 |
| 1.2.2.2 电转化与阳性重组子的筛选 | 第69页 |
| 1.2.2.3 缺失株M5-90-△per的PCR鉴定 | 第69-70页 |
| 1.2.2.4 缺失株M5-90-△per的遗传稳定性检测 | 第70页 |
| 2 结果与分析 | 第70-77页 |
| 2.1 同源重组质粒pGEM-△per的构建 | 第70-73页 |
| 2.2 缺失株M5-90-△per的PCR鉴定 | 第73-76页 |
| 2.3 缺失株M5-90-△per的遗传稳定性检测 | 第76-77页 |
| 3 讨论 | 第77-79页 |
| 4 小结 | 第79页 |
| 5 结论 | 第79页 |
| 6 创新点 | 第79-80页 |
| 第二部分 B.melitensis M5-90及其缺失株M5-90-△per感染条件下RAW264.7细胞差异基因表达谱、差异miRNAs的鉴定与联合分析 | 第80-128页 |
| 前言 | 第80-82页 |
| 1 材料与方法 | 第82-95页 |
| 1.1 实验材料 | 第82-84页 |
| 1.1.1 细胞 | 第82页 |
| 1.1.2 菌种 | 第82页 |
| 1.1.3 试剂 | 第82-83页 |
| 1.1.4 实验仪器 | 第83页 |
| 1.1.5 主要溶液配制方法 | 第83-84页 |
| 1.2 实验方法 | 第84-95页 |
| 1.2.1 miRNA Microarray-Single基因表达谱芯片实验 | 第84-87页 |
| 1.2.1.1 细胞培养 | 第84页 |
| 1.2.1.2 菌株培养 | 第84页 |
| 1.2.1.3 芯片实验样品制备 | 第84-85页 |
| 1.2.1.4 miRNA Microarray-Single基因表达谱芯片实验 | 第85-86页 |
| 1.2.1.5 qRT-PCR验证miRNA Microarray-Single基因表达谱芯片结果 | 第86-87页 |
| 1.2.2 Agilent基因表达谱芯片实验 | 第87-90页 |
| 1.2.2.1 细胞培养 | 第87页 |
| 1.2.2.2 菌株培养 | 第87页 |
| 1.2.2.3 Agilent基因表达谱芯片实验样品制备 | 第87页 |
| 1.2.2.4 Agilent基因表达谱芯片实验 | 第87-89页 |
| 1.2.2.5 qRT-PCR验证Agilent基因表达谱芯片结果 | 第89-90页 |
| 1.2.3 miRNA表达谱芯片与Agilent基因表达谱芯片结果的联合分析 | 第90-95页 |
| 1.2.3.1 联合分析流程 | 第90-91页 |
| 1.2.3.2 优化mimic转染效率 | 第91-92页 |
| 1.2.3.3 qRT-PCR验证预测的靶基因 | 第92页 |
| 1.2.3.4 双荧光素酶报告基因重组质粒的构建 | 第92-94页 |
| 1.2.3.5 共转染 | 第94页 |
| 1.2.3.6 双荧光素酶报告基因的检测 | 第94-95页 |
| 1.2.3.7 突变体双荧光素酶报告基因实验 | 第95页 |
| 2 结果与分析 | 第95-123页 |
| 2.1 miRNA Microarray-Single基因表达谱芯片结果 | 第95-97页 |
| 2.2 qRT-PCR验证miRNA Microarray-Single基因表达谱芯片结果 | 第97-98页 |
| 2.3 Agilent基因表达谱芯片结果 | 第98-105页 |
| 2.4 miRNA-mRNA联合分析 | 第105-110页 |
| 2.5 miRNA-mRNA联合分析结果的qRT-PCR验证 | 第110-113页 |
| 2.6 流式细胞仪筛选mimic转染的最佳浓度 | 第113-114页 |
| 2.7 qRT-PCR验证靶基因Slc5a3与Tbc1d14 | 第114-116页 |
| 2.8 miR-146b-5p靶向结合并调节Tbc1d14 | 第116-117页 |
| 2.9 双荧光素酶报告基因实验验证miR-146b-5p靶向调节Tbc1d14 | 第117-123页 |
| 3 讨论 | 第123-127页 |
| 4 小结 | 第127页 |
| 5 结论 | 第127页 |
| 6 创新点 | 第127-128页 |
| 第三部分 B.melitensis M5-90感染条件下miR-146b-5p对RAW264.7自噬的影响 | 第128-153页 |
| 前言 | 第128-130页 |
| 1 材料与方法 | 第130-136页 |
| 1.1 实验材料 | 第130-132页 |
| 1.1.1 细胞 | 第130页 |
| 1.1.2 菌种 | 第130页 |
| 1.1.3 试剂 | 第130-131页 |
| 1.1.4 实验仪器 | 第131页 |
| 1.1.5 主要溶液配制方法 | 第131-132页 |
| 1.2 实验方法 | 第132-136页 |
| 1.2.1 细胞培养 | 第133页 |
| 1.2.2 菌种培养与感染 | 第133页 |
| 1.2.3 B.melitensis M5-90、M5-90-△per感染条件下RAW264.7自噬分析 | 第133-135页 |
| 1.2.3.1 Western-blot检测LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白 | 第133-134页 |
| 1.2.3.2 透射电镜检测自噬溶酶体 | 第134-135页 |
| 1.2.4 qRT-PCR验证miR-146b-5p的过表达与抑制表达 | 第135页 |
| 1.2.5 B.melitensis M5-90感染条件下miR-146b-5p对RAW264.7自噬的影 | 第135-136页 |
| 1.2.5.1 Western-blot检测LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白 | 第135-136页 |
| 1.2.5.2 透射电镜检测自噬溶酶体 | 第136页 |
| 2 结果与分析 | 第136-149页 |
| 2.1 缺失株M5-90-△per感染RAW264.7细胞的LC3-Ⅱ/Ⅰ显著降低 | 第136-137页 |
| 2.2 缺失株M5-90-△per感染RAW264.7细胞的自噬溶酶体数显著减少 | 第137-140页 |
| 2.3 qRT-PCR验证miR-146b-5p的过表达与抑制表达 | 第140-141页 |
| 2.4 过表达miR-146b-5p导致LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著降低 | 第141-143页 |
| 2.5 过表达miR-146b-5p导致RAW264.7的自噬溶酶体数显著减少 | 第143-149页 |
| 3 讨论 | 第149-152页 |
| 4 小结 | 第152页 |
| 5 结论 | 第152页 |
| 6 创新点 | 第152-153页 |
| 第四部分 B. melitensis M5-90感染条件下Tbc1d14对RAW264.7自噬的影响 | 第153-180页 |
| 前言 | 第153-155页 |
| 1 材料与方法 | 第155-160页 |
| 1.1 实验材料 | 第155页 |
| 1.1.1 细胞 | 第155页 |
| 1.1.2 菌种 | 第155页 |
| 1.1.3 试剂 | 第155页 |
| 1.1.4 实验仪器 | 第155页 |
| 1.1.5 主要溶液配制方法 | 第155页 |
| 1.2 实验方法 | 第155-160页 |
| 1.2.1 细胞培养 | 第155页 |
| 1.2.2 菌种培养与感染 | 第155页 |
| 1.2.3 携带Tbc1d14、GFP的重组腺病毒的制备 | 第155-158页 |
| 1.2.4 qRT-PCR验证Tbc1d14基因的过表达 | 第158-159页 |
| 1.2.5 过表达Tbc1d14导致miR-146b-5p介导的RAW264.7自噬升高 | 第159页 |
| 1.2.6 携带Tbc1d14、GFP的重组腺病毒感染RAW264.7后DGE测序分析 | 第159-160页 |
| 1.2.7 DGE测序分析结果的qRT-PCR验证 | 第160页 |
| 2 结果与分析 | 第160-177页 |
| 2.1 Tbc1d14、GFP的重组腺病毒的制备 | 第160-162页 |
| 2.2 重组腺病毒感染效率的检测以及qRT-PCR验证Tbc1d14基因的表达 | 第162-165页 |
| 2.3 过表达Tbc1d14导致miR-146b-5p介导的RAW264.7自噬升高 | 第165-170页 |
| 2.4 DGE测序结果 | 第170-175页 |
| 2.5 DGE测序结果的qRT-PCR验证 | 第175-177页 |
| 3 讨论 | 第177-179页 |
| 4 小结 | 第179页 |
| 5 结论 | 第179页 |
| 6 创新点 | 第179-180页 |
| 全文结论 | 第180-181页 |
| 展望 | 第181-182页 |
| 参考文献 | 第182-203页 |
| 中英文缩略词对照表 | 第203-207页 |
| 附录 | 第207-235页 |
| 致谢 | 第235页 |
