| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-21页 |
| 1.1 引言 | 第9-13页 |
| 1.2 肿瘤融合免疫毒素靶向治疗的发展状况 | 第13-18页 |
| 1.2.1 载体的应用 | 第13-14页 |
| 1.2.2 细胞毒效应分子绿脓杆菌外毒素PE的作用机制及设计 | 第14-16页 |
| 1.2.3 重组免疫毒素的制备 | 第16-17页 |
| 1.2.4 重组ITs的展望与挑战 | 第17-18页 |
| 1.3 论文研究目的和内容 | 第18-21页 |
| 第二章 抗CEA纳米抗体的制备 | 第21-34页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料 | 第21-24页 |
| 2.2.1 细菌菌株 | 第21页 |
| 2.2.2 质粒载体 | 第21-22页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第22页 |
| 2.2.4 主要试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.5 主要溶液配制 | 第23-24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-27页 |
| 2.3.1 CEA免疫羊驼 | 第24页 |
| 2.3.2 CEA纳米抗体库的构建 | 第24页 |
| 2.3.3 针对CEA蛋白的纳米抗体的淘选 | 第24-25页 |
| 2.3.4 CEA纳米抗体的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.5 CEA纳米抗体的原核表达及纯化 | 第26页 |
| 2.3.6 Biacore测定CEA纳米抗体亲和常数 | 第26-27页 |
| 2.4 实验结果 | 第27-32页 |
| 2.4.1 CEA免疫纳米抗体的建库 | 第27页 |
| 2.4.2 针对CEA蛋白的噬菌体展示库淘选结果 | 第27-29页 |
| 2.4.3 细胞ELISA鉴定 | 第29-30页 |
| 2.4.4 CEA纳米抗体表达纯化结果 | 第30-32页 |
| 2.4.5 CEA纳米抗体亲和力测定结果 | 第32页 |
| 2.5 讨论 | 第32-34页 |
| 第三章 PET28A-11C12/PE40的构建和融合蛋白的表达与纯化 | 第34-55页 |
| 3.1 引言 | 第34页 |
| 3.2 实验材料 | 第34-39页 |
| 3.2.1 细菌菌株 | 第34页 |
| 3.2.2 质粒载体 | 第34-36页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第36-37页 |
| 3.2.4 主要试剂 | 第37-38页 |
| 3.2.5 引物设计 | 第38页 |
| 3.2.6 主要溶液配制 | 第38-39页 |
| 3.3 实验方法 | 第39-48页 |
| 3.3.1 pET28a-11C12/PE40重组质粒的构建 | 第39-44页 |
| 3.3.2 pET28a-11C12/PE40重组质粒的转化 | 第44-45页 |
| 3.3.3 pET28a-11C12/PE40重组质粒的鉴定 | 第45-46页 |
| 3.3.4 11C12/PE40融合蛋白的鉴定 | 第46页 |
| 3.3.5 11C12/PE40融合蛋白表达和纯化 | 第46-47页 |
| 3.3.6 Western blot鉴定融合蛋白11C12/PE40中的11C12和PE40 | 第47-48页 |
| 3.4 实验结果 | 第48-52页 |
| 3.4.1 PCR扩增结果 | 第48-49页 |
| 3.4.2 pET28a-11C12/PE40质粒及其双酶切验证结果 | 第49页 |
| 3.4.3 重组表达质粒pET28a-11C12/PE40测序结果 | 第49页 |
| 3.4.4 重组质粒pET28a-11C12/PE40的诱导表达 | 第49-52页 |
| 3.5 讨论 | 第52-55页 |
| 第四章 PET28A-11C12/PE40/2F2的构建和融合蛋白的表达与纯化 | 第55-67页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 实验材料 | 第55-56页 |
| 4.2.1 细菌菌株 | 第55页 |
| 4.2.2 质粒载体 | 第55页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第55页 |
| 4.2.4 主要试剂 | 第55页 |
| 4.2.5 引物设计 | 第55-56页 |
| 4.2.6 主要溶液配制 | 第56页 |
| 4.3 实验方法 | 第56-60页 |
| 4.3.1 pET28a-11C12/PE40/2F2融合免疫毒素载体的构建 | 第56-59页 |
| 4.3.2 融合免疫毒素连接产物的转化 | 第59-60页 |
| 4.3.3 重组pET28a-11C12/PE40/2F2表达载体的鉴定 | 第60页 |
| 4.3.4 保护性免疫毒素的分离纯化及westernblot鉴定 | 第60页 |
| 4.4 实验结果 | 第60-65页 |
| 4.4.1 11C12/PE40、2F2PCR扩增结果 | 第60页 |
| 4.4.2 pET28a-11C12/PE40/2F2质粒及其酶切验证结果 | 第60-61页 |
| 4.4.3 重组表达质粒pET28a-11C12/PE40/2F2测序结果 | 第61页 |
| 4.4.4 保护性免疫毒素的鉴定及分离纯化 | 第61-65页 |
| 4.5 讨论 | 第65-67页 |
| 第五章 11C12/PE40和11C12/PE40/2F2的细胞毒性实验 | 第67-77页 |
| 5.1 引言 | 第67页 |
| 5.2 实验材料 | 第67-69页 |
| 5.2.1 细胞株 | 第67页 |
| 5.2.2 主要仪器 | 第67-68页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第68页 |
| 5.2.4 主要溶液配制 | 第68-69页 |
| 5.3 实验方法 | 第69-71页 |
| 5.3.1 SW480和LoVo细胞中基质金属蛋白酶2和9活性比色法定量检测 | 第69-70页 |
| 5.3.2 SW480和LoVo细胞间接免疫荧光检测 | 第70页 |
| 5.3.3 两种重组免疫毒素对人结直肠癌细胞系SW480和LoVo的活性检测 | 第70-71页 |
| 5.4 实验结果 | 第71-75页 |
| 5.4.1 SW480和LoVo细胞中MMP2/MMP9的检测 | 第71-72页 |
| 5.4.2 SW480和LoVo细胞免疫荧光检测 | 第72页 |
| 5.4.3 11C12/PE40和11C12/PE40/2F2对SW480和LoVo细胞的MTT实验 | 第72-75页 |
| 5.5 讨论 | 第75-77页 |
| 结论和展望 | 第77-80页 |
| 致谢 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-83页 |
