| 摘要 | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-11页 |
| 文献综述 | 第11-17页 |
| 1. 黑色素的形成和调控 | 第11-13页 |
| 1.1 黑色素细胞的形成 | 第11页 |
| 1.2 黑色素的合成 | 第11-12页 |
| 1.3 黑色素合成的调控 | 第12-13页 |
| 2. 黑色素合成相关基因的研究 | 第13-14页 |
| 2.1 黑色素皮质素受体1(MC1R) | 第13页 |
| 2.2 小眼畸形相关转录因子(MITF) | 第13-14页 |
| 2.3 酪氨酸酶基因家族基因(tyr/tyrp1/tyrp2) | 第14页 |
| 3. miRNA的相关研究 | 第14-15页 |
| 3.1 miRNA的生物学功能 | 第14-15页 |
| 3.2 miRNA和黑色素形成 | 第15页 |
| 3.3 miR-338-3p的研究进展 | 第15页 |
| 4. 本研究的目的与意义 | 第15-17页 |
| 实验一、miR-338-3p靶基因的预测 | 第17-31页 |
| 1 材料 | 第17-18页 |
| 1.1 实验材料 | 第17页 |
| 1.2 实验主要仪器 | 第17页 |
| 1.3 实验主要试剂及耗材 | 第17-18页 |
| 1.4 实验主要溶液的配制 | 第18页 |
| 2 实验方法 | 第18-26页 |
| 2.1 羊驼黑色素细胞培养 | 第18-19页 |
| 2.1.1 羊驼黑色素细胞的复苏 | 第18页 |
| 2.1.2 羊驼黑色素细胞的传代 | 第18-19页 |
| 2.1.3 羊驼黑色素细胞的冻存 | 第19页 |
| 2.2 羊驼黑色素细胞总RNA提取 | 第19-20页 |
| 2.3 cDNA的合成 | 第20-21页 |
| 2.4 pPG/miR/eGFP/Blasticidin-1pa-miR-338-3p过表达载体的构建 | 第21-22页 |
| 2.5 pmirGLO-MC1R-3'UTR双荧光素报告载体构建 | 第22-24页 |
| 2.5.1 PCR扩增靶基因MC1R 3'UTR | 第22-23页 |
| 2.5.2 快速琼脂糖凝胶回收MC1R条带与转化克隆 | 第23页 |
| 2.5.2.1 回收MC1R条带 | 第23页 |
| 2.5.2.2 在DH5α感受态细胞中转化克隆 | 第23页 |
| 2.5.3 构建MC1R双荧光报告载体 | 第23-24页 |
| 2.6 去内毒素质粒的提取 | 第24-25页 |
| 2.7 共转染293T细胞检测荧光信号 | 第25-26页 |
| 2.7.1 复苏培养293T细胞: | 第25页 |
| 2.7.2 共转染293 T细胞: | 第25页 |
| 2.7.3 双荧光素酶活性检测: | 第25-26页 |
| 3 结果 | 第26-30页 |
| 3.1 羊驼miR-338-3p序列获得 | 第26页 |
| 3.2 miR-338-3p靶基因的预测 | 第26-27页 |
| 3.3 miR-338-3p过表达载体 | 第27-28页 |
| 3.4 pmirGLO-MC1R-3'UTR载体测序结果 | 第28-29页 |
| 3.5 转染293 T细胞之后的荧光活性检测 | 第29页 |
| 3.6 双荧光素酶报告基因靶基因验证 | 第29-30页 |
| 4 小结 | 第30-31页 |
| 实验二、qRT-PCR检测反转录水平的表达差异 | 第31-40页 |
| 1 材料 | 第31-32页 |
| 1.1 实验材料 | 第31页 |
| 1.2 实验主要仪器 | 第31页 |
| 1.3 实验主要试剂和耗材 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-35页 |
| 2.1 过表达载体的转染 | 第32页 |
| 2.2 引物设计 | 第32-33页 |
| 2.3 qRT-PCR检测转染后miR-338-3p的表达差异性 | 第33-34页 |
| 2.4 qRT-PCR测定各目的基因的表达差异性 | 第34-35页 |
| 3 结果 | 第35-39页 |
| 3.1 载体转染效率鉴定 | 第35-36页 |
| 3.2 总RNA质量鉴定 | 第36页 |
| 3.3 转染过表达载体后,miR-338-3p在转录水平的表达量 | 第36-37页 |
| 3.4 转染过表达载体后,各目的基因在转录水平的表达量 | 第37-39页 |
| 4 小结 | 第39-40页 |
| 实验三、蛋白免疫印迹测定蛋白表达差异 | 第40-46页 |
| 1 材料 | 第40-41页 |
| 1.1 实验材料 | 第40页 |
| 1.2 实验主要仪器 | 第40页 |
| 1.3 实验主要试剂和耗材 | 第40页 |
| 1.4 实验主要溶液的配制 | 第40-41页 |
| 2 实验方法 | 第41-43页 |
| 2.1 黑色素细胞总蛋白的提取 | 第41页 |
| 2.2 考马斯亮蓝染色液检测总蛋白 | 第41-42页 |
| 2.3 蛋白免疫印迹检测目的基因蛋白表达水平 | 第42-43页 |
| 3 结果 | 第43-45页 |
| 4 小结 | 第45-46页 |
| 实验四、miR-338-3p对黑色素合成的影响 | 第46-49页 |
| 1 材料 | 第46页 |
| 1.1 实验材料 | 第46页 |
| 1.2 实验主要仪器 | 第46页 |
| 1.3 实验主要试剂和耗材 | 第46页 |
| 1.4 实验主要溶液的配制 | 第46页 |
| 2 实验方法 | 第46-47页 |
| 3 结果 | 第47-48页 |
| 4 小结 | 第48-49页 |
| 讨论 | 第49-52页 |
| 1 miR-338-3p与黑色素合成 | 第49-50页 |
| 2 miR-338-3p调控MC1R基因影响黑色素形成 | 第50-51页 |
| 3 创新与展望 | 第51-52页 |
| 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-58页 |
| Abstract | 第58-59页 |
| 致谢 | 第60页 |
