| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 文献综述 | 第12-18页 |
| 1.1 苦荞概述 | 第12页 |
| 1.2 黄酮醇化合物 | 第12-15页 |
| 1.2.1 黄酮醇 | 第12-13页 |
| 1.2.2 黄酮醇化合物的功能 | 第13-14页 |
| 1.2.2.1 在植物中的作用 | 第13页 |
| 1.2.2.2 在动物中的作用 | 第13-14页 |
| 1.2.3 黄酮醇的合成途径 | 第14-15页 |
| 1.3 黄酮醇合酶 | 第15-18页 |
| 1.3.1 黄酮醇合酶基因 | 第15-16页 |
| 1.3.2 FLS的催化机制 | 第16页 |
| 1.3.3 FLS同源基因 | 第16-17页 |
| 1.3.4 植物FLS表达调控 | 第17-18页 |
| 2 本研究的目的和意义 | 第18页 |
| 3 实验材料、试剂与仪器 | 第18-20页 |
| 3.1 实验材料 | 第18-19页 |
| 3.1.1 植株品种 | 第18页 |
| 3.1.2 菌株与质粒 | 第18-19页 |
| 3.2 酶、试剂盒与生化试剂 | 第19页 |
| 3.3 主要实验仪器 | 第19-20页 |
| 4 实验方法 | 第20-31页 |
| 4.1 苦荞黄酮醇合酶FtFLS4和FtFLS5的基因克隆 | 第20-23页 |
| 4.1.1 苦荞花RNA的提取 | 第20-21页 |
| 4.1.2 第一链cDNA的制备 | 第21页 |
| 4.1.3 苦荞黄酮醇合酶基因FtFLS4和FtFLS5的克隆 | 第21-23页 |
| 4.1.4 苦荞黄酮醇合酶基因FtFLS4和FtFLS5的生物信息学分析 | 第23页 |
| 4.2 FtFLS4和FtFLS5的原核表达和酶催功能鉴定 | 第23-28页 |
| 4.2.1 FtFLS4和FtFLS5的原核表达载体构建 | 第23-24页 |
| 1. 引物设计 | 第23页 |
| 2. 反应体系 | 第23-24页 |
| 4.2.2 苦荞黄酮醇合酶FtFLS4和FtFLS5在大肠杆菌中的表达 | 第24-28页 |
| 4.2.2.1 重组蛋白的SDS-PAGE | 第24-25页 |
| 4.2.2.2 重组蛋白的亲和层析 | 第25-26页 |
| 4.2.2.3 重组电泳纯蛋白的超滤 | 第26页 |
| 4.2.2.4 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 | 第26-27页 |
| 4.2.2.5 重组蛋白酶活的定性鉴定(TLC法) | 第27页 |
| 4.2.2.6 重组蛋白的酶活测定 | 第27-28页 |
| 4.3 苦荞花期黄酮醇合酶的表达分析 | 第28-31页 |
| 4.3.1 苦荞总黄酮的提取及测定 | 第28-29页 |
| 4.3.1.1 苦荞总黄酮的提取 | 第28页 |
| 4.3.1.2 芦丁标准曲线的建立 | 第28-29页 |
| 4.3.1.3 AlC13法测定总黄酮含量 | 第29页 |
| 4.3.2 高效液相法测定黄酮醇含量 | 第29-30页 |
| 4.3.2.1 标准溶液的配制与储备 | 第29页 |
| 4.3.2.2 高效样品处理方法 | 第29页 |
| 4.3.2.3 色谱条件 | 第29-30页 |
| 4.3.2.4 高效液相标准曲线绘制 | 第30页 |
| 4.3.3 苦荞黄酮醇合酶的表达量分析 | 第30-31页 |
| 4.3.3.1 苦荞茎、叶和花总RNA的提取 | 第30页 |
| 4.3.3.2 第一链cDNA的制备 | 第30页 |
| 4.3.3.3 Real-Time PCR引物的设计 | 第30页 |
| 4.3.3.4 实时荧光定量PCR程序 | 第30-31页 |
| 5 结果与分析 | 第31-44页 |
| 5.1 FtFLS4和FtFLS5的基因克隆及序列分析 | 第31-37页 |
| 5.1.1 苦荞花RNA的提取 | 第31页 |
| 5.1.2 苦荞FtFLS4和FtFLS5的克隆 | 第31-32页 |
| 5.1.3 苦荞FtFLS4和FtFLS5的生物信息学分析 | 第32-37页 |
| 5.1.3.1 FtFLS4和FtFLS5多重序列比对分析 | 第32-33页 |
| 5.1.3.2 FtFLS4和FtFLS5进化树分析 | 第33-34页 |
| 5.1.3.3 FtFLS4和FtFLS5二级结构分析 | 第34页 |
| 5.1.3.4 FtFLS4和FtFLS5三级结构分析 | 第34-35页 |
| 5.1.3.5 FtFLS4和FtFLS5的分子对接 | 第35-37页 |
| 5.2 FtFLS4和FtFLS5的原核表达和酶活测定 | 第37-41页 |
| 5.2.1 pET30b-FtFLS4和pET30b-FtFLS5表达载体的构建 | 第37页 |
| 5.2.2 苦荞FtFLS4和FtFLS5在大肠杆菌中的诱导表达 | 第37-38页 |
| 5.2.3 重组FtFLS4和FtFLS5的纯化 | 第38-39页 |
| 5.2.4 重组FtFLS4和FtFLS5酶活的定性鉴定 | 第39-40页 |
| 5.2.5 槲皮素、山奈酚和杨梅素标准曲线的建立 | 第40页 |
| 5.2.6 FtFLS的酶活测定 | 第40-41页 |
| 5.3 苦荞花期黄酮醇合酶的表达分析 | 第41-44页 |
| 5.3.1 苦荞总黄酮的含量测定 | 第41页 |
| 5.3.2 高效液相法测定黄酮醇化合物含量 | 第41-42页 |
| 5.3.2.1 标准曲线绘制 | 第41-42页 |
| 5.3.2.2 高效液相法测定黄酮醇化合物含量 | 第42页 |
| 5.3.3 苦荞黄酮醇合酶表达量分析 | 第42-43页 |
| 5.3.4 苦荞黄酮醇合酶与黄酮含量的相关性分析 | 第43-44页 |
| 5.3.4.1 苦荞黄酮醇合酶与总黄酮含量相关性 | 第43页 |
| 5.3.4.2 苦荞黄酮醇合酶与黄酮醇含量相关性 | 第43-44页 |
| 6 讨论 | 第44-46页 |
| 6.1 苦荞黄酮醇合酶同源基因的序列分析 | 第44页 |
| 6.2 苦荞黄酮醇合酶活性分析 | 第44-45页 |
| 6.3 苦荞黄酮醇合酶的表达分析 | 第45-46页 |
| 7 结论与展望 | 第46-48页 |
| 7.1 结论 | 第46-47页 |
| 7.2 展望 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第54页 |
