| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| 1.1 手性化合物的简介 | 第12页 |
| 1.2 生物催化制备手性化合物概述 | 第12-14页 |
| 1.2.1 醛酮还原酶催化的反应机制 | 第13页 |
| 1.2.2 还原型辅酶Ⅰ概述 | 第13-14页 |
| 1.2.3 醛酮还原酶生物催化产业化中的关键问题 | 第14页 |
| 1.3 辅酶再生方法概述 | 第14-17页 |
| 1.3.1 酶法 | 第14-16页 |
| 1.3.2 电化学法 | 第16页 |
| 1.3.3 化学法 | 第16页 |
| 1.3.4 光化学法 | 第16-17页 |
| 1.4 酶偶联法制备手性氨基酸和手性醇的研究现状 | 第17-19页 |
| 1.4.1 酶偶联法的类型 | 第17-18页 |
| 1.4.2 制备手性氨基酸和手性醇的研究现状 | 第18-19页 |
| 1.5 本课题的研究目的和研究意义 | 第19-21页 |
| 1.5.1 辅酶循环系统的构建 | 第19页 |
| 1.5.2 L2氨基丁酸的重要性 | 第19-20页 |
| 1.5.3 (S)1(2,6-二氯3氟苯基)乙醇的重要性 | 第20-21页 |
| 1.6 本课题研究的主要内容 | 第21-22页 |
| 第二章 辅酶再生偶联反应制备L2氨基丁酸 | 第22-52页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料和仪器 | 第22-25页 |
| 2.2.1 质粒 | 第22-23页 |
| 2.2.2 菌株 | 第23页 |
| 2.2.3 试剂和仪器 | 第23-25页 |
| 2.2.4 培养基 | 第25页 |
| 2.2.5 主要溶液和缓冲液 | 第25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-38页 |
| 2.3.1 菌种的培养与保藏 | 第25页 |
| 2.3.2 菌种总DNA的制备 | 第25-26页 |
| 2.3.3 E. coli DH5α和E. coli BL21 (DE3)感受态细胞的制备 | 第26页 |
| 2.3.4 大肠杆菌质粒的转化 | 第26页 |
| 2.3.5 碱裂解法抽提大肠杆菌质粒 | 第26-27页 |
| 2.3.6 PCR反应液或酶切反应液中DNA片段的回收 | 第27页 |
| 2.3.7 胶回收DNA目的基因片段 | 第27页 |
| 2.3.8 DNA电泳 | 第27-28页 |
| 2.3.9 DNA的酶切和连接 | 第28页 |
| 2.3.10 PCR扩增目的基因 | 第28-29页 |
| 2.3.11 重组质粒的构建 | 第29-30页 |
| 2.3.12 共表达重组菌株的构建 | 第30页 |
| 2.3.13 粗酶液的制备 | 第30页 |
| 2.3.14 重组酶蛋白的试表达 | 第30-31页 |
| 2.3.15 重组酶蛋白表达条件的优化 | 第31-32页 |
| 2.3.16 甲酸脱氢酶酶活的测定 | 第32-33页 |
| 2.3.17 苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶酶活的测定 | 第33页 |
| 2.3.18 粗酶液蛋白质含量的测定 | 第33页 |
| 2.3.19 SDS-PAGE蛋白电泳检测 | 第33-34页 |
| 2.3.20 产物含量的测定 | 第34-35页 |
| 2.3.21 共表达体系催化制备L2氨基丁酸 | 第35页 |
| 2.3.22 反应条件对转化反应的影响 | 第35-36页 |
| 2.3.23 L2氨基丁酸的放大制备 | 第36-37页 |
| 2.3.24 L2氨基丁酸的纯化 | 第37-38页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第38-50页 |
| 2.4.1 苏氨酸脱氨酶表达质粒的构建 | 第38页 |
| 2.4.2 甲酸脱氢酶表达质粒的构建 | 第38-39页 |
| 2.4.3 亮氨酸脱氢酶表达质粒的构建 | 第39页 |
| 2.4.4 重组蛋白的试表达 | 第39页 |
| 2.4.5 重组酶蛋白E. coli BL21-TD表达条件的优化 | 第39-40页 |
| 2.4.6 重组酶蛋白E. coli BL21-FDH表达条件的优化 | 第40-42页 |
| 2.4.7 重组酶蛋白E. coli BL21-LDH表达条件的优化 | 第42-43页 |
| 2.4.8 共表达重组菌株的蛋白条件优化 | 第43页 |
| 2.4.9 粗酶液蛋白质含量的确定 | 第43-44页 |
| 2.4.10标准品的HPLC分析 | 第44-46页 |
| 2.4.11酶活的确定 | 第46页 |
| 2.4.12反应条件对转化反应的影响 | 第46-49页 |
| 2.4.13 L2氨基丁酸的放大制备 | 第49页 |
| 2.4.14 L2氨基丁酸的纯化结果 | 第49-50页 |
| 2.4.15 L2氨基丁酸结构的鉴定 | 第50页 |
| 2.5 小结 | 第50-52页 |
| 第三章 辅酶再生偶联反应制备(S)1(2,6-二氯3氟苯基)乙醇 | 第52-64页 |
| 3.1 引言 | 第52页 |
| 3.2 实验材料和试剂 | 第52页 |
| 3.3 实验方法 | 第52-56页 |
| 3.3.1 构建含有乙醇脱氢酶基因片段的质粒 | 第52-53页 |
| 3.3.2 共表达重组菌株的构建 | 第53页 |
| 3.3.3 重组酶蛋白表达条件的优化 | 第53-54页 |
| 3.3.4 酶活的测定 | 第54页 |
| 3.3.5 产物含量的测定 | 第54页 |
| 3.3.6 共表达体系催化制备(S)1(2,6-二氯3氟苯基)乙醇 | 第54页 |
| 3.3.7 反应条件对转化反应的影响 | 第54-55页 |
| 3.3.8 柱层析法分离产物 | 第55-56页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第56-62页 |
| 3.4.1 乙醇脱氢酶表达质粒的构建 | 第56页 |
| 3.4.2 重组酶蛋白E. coli BL21-ADH表达条件的优化 | 第56-57页 |
| 3.4.3 共表达重组菌株的蛋白条件优化 | 第57-58页 |
| 3.4.4 产物的HPLC分析 | 第58-59页 |
| 3.4.5 酶活及蛋白质含量的确定 | 第59页 |
| 3.4.6 反应条件对转化反应的影响 | 第59-62页 |
| 3.4.7 柱层析法分离产物 | 第62页 |
| 3.4.8 (S)1(2,6-二氯3氟苯基)乙醇结构的鉴定 | 第62页 |
| 3.5 小结 | 第62-64页 |
| 第四章 结论与展望 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 附录 | 第72-76页 |
| 致谢 | 第76-78页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第78-79页 |
