| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 缩略语索引 | 第15-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-32页 |
| 1.1 失眠 | 第16页 |
| 1.2 失眠症的治疗现状 | 第16-19页 |
| 1.2.1 失眠的非药物疗法 | 第16页 |
| 1.2.2 失眠的药物疗法 | 第16-19页 |
| 1.2.2.1 传统镇静催眠药物 | 第16-18页 |
| 1.2.2.2 治疗失眠药物的新方向 | 第18-19页 |
| 1.3 G蛋白偶联受体 | 第19-20页 |
| 1.4 G蛋白偶联受体受体与睡眠调节 | 第20-25页 |
| 1.4.1 多巴胺受体与睡眠调节 | 第20-22页 |
| 1.4.2 五羟色胺受体与睡眠调节 | 第22-24页 |
| 1.4.3 食欲肽受体与睡眠调节 | 第24-25页 |
| 1.5 荧光共振能量转移(FRET)技术 | 第25-27页 |
| 1.6 本论文研究意义 | 第27-29页 |
| 1.7 本实验研究技术路线 | 第29-32页 |
| 1.7.1 构建载体 | 第29页 |
| 1.7.2 构建完成的载体瞬时转染HEK293细胞进行表达鉴定 | 第29页 |
| 1.7.3 建立多巴胺D_2/D_3受体分子和五羟色胺5HT_(2A/1B)受体分子探针的高表达稳定细胞系并鉴定表达结果 | 第29-30页 |
| 1.7.4 用食欲肽OX_2受体分子对化合物活性进行筛选 | 第30-32页 |
| 第二章 多巴胺诱导表达载体和五羟色胺受体分子探针的构建 | 第32-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第32-34页 |
| 2.1.1 载体、菌种及质粒 | 第32页 |
| 2.1.2 实验仪器和设备 | 第32-33页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第33-34页 |
| 2.1.4 实验试剂配方 | 第34页 |
| 2.2 实验内容 | 第34-48页 |
| 2.2.1 构建多巴胺诱导表达载体和五羟色胺受体分子探针质粒 | 第34-48页 |
| 2.2.1.1 Clontech kit | 第35-36页 |
| 2.2.1.2 In-Fusion HD Cloning Kit引物设计原理 | 第36-38页 |
| 2.2.1.3 普通PCR扩增目的片段以及突变目的片段 | 第38-42页 |
| 2.2.1.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第42页 |
| 2.2.1.6 胶回收(promega) | 第42-43页 |
| 2.2.1.7 clontech kit连接反应 | 第43页 |
| 2.2.1.8 制备E.coli DH 5α感受态细胞 | 第43-44页 |
| 2.2.1.9 转化(E.coli DH 5α感受态细胞) | 第44-45页 |
| 2.2.1.10 菌落PCR | 第45-46页 |
| 2.2.1.11 抽提质粒 | 第46-47页 |
| 2.2.1.12 比对序列 | 第47页 |
| 2.2.1.13 质粒大提(QIAGEN kit) | 第47-48页 |
| 2.3 实验结果 | 第48-55页 |
| 2.3.1 构建D_2和D_3受体的表达载体 | 第48-51页 |
| 2.3.1.1 纯化PCR扩增目的基因片段产物 | 第48-49页 |
| 2.3.1.2 连接目的片段并进行菌液PCR验证 | 第49-50页 |
| 2.3.1.3 pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-D_2/D_3序列验证抽提质粒 | 第50-51页 |
| 2.3.1.4 抽提质粒 | 第51页 |
| 2.3.2 构建五羟色胺受体质粒分子探针 | 第51-55页 |
| 2.3.2.1 按照突变试剂盒的原理先将FLASH片段的后18个碱基引入并菌落PCR验证 | 第51-52页 |
| 2.3.2.2 按照突变试剂盒的原理再将FLASH片段的前18个碱基引入并菌落PCR验证 | 第52-53页 |
| 2.3.2.3 插入片段的序列验证 | 第53-54页 |
| 2.3.2.4 抽提质粒 | 第54-55页 |
| 2.3.2.5 pOG44抽提质粒 | 第55页 |
| 2.4 小结 | 第55-56页 |
| 2.5 讨论 | 第56-58页 |
| 第三章 多巴胺受体诱导表达稳定株和五羟色胺受体分子探针稳定株的构建及验证 | 第58-80页 |
| 3.1 实验材料 | 第58-62页 |
| 3.1.1 实验用细胞 | 第58页 |
| 3.1.2 实验试剂 | 第58-60页 |
| 3.1.3 实验仪器及实验设备 | 第60-61页 |
| 3.1.4 试剂配方 | 第61-62页 |
| 3.2 实验方法 | 第62-70页 |
| 3.2.1 细胞培养 | 第62页 |
| 3.2.2 细胞复苏 | 第62页 |
| 3.2.3 细胞传代 | 第62-63页 |
| 3.2.4 细胞冻存 | 第63页 |
| 3.2.5 细胞计数 | 第63-64页 |
| 3.2.6 细胞转染 | 第64-70页 |
| 3.2.6.1 多巴胺、五羟色胺受体分子探针质粒瞬时高表达实验 | 第65页 |
| 3.2.6.2 Western blotting检测分子探针的有效性 | 第65-67页 |
| 3.2.6.3 建立诱导表达多巴胺、五羟色胺受体分子探针的稳定细胞系 | 第67-68页 |
| 3.2.6.4 多巴胺受体分子探针稳定细胞系的P-ERK活性测定实验 | 第68-69页 |
| 3.2.6.5 五羟色胺受体分子探针稳定细胞系的荧光鉴定和FRET实验 | 第69-70页 |
| 3.3 实验结果 | 第70-76页 |
| 3.3.1 五羟色胺分子探针质粒瞬时转染HEK293T细胞 | 第70-71页 |
| 3.3.2 多巴胺受体质粒瞬时转染后,Western blot检测结果 | 第71-72页 |
| 3.3.3 质粒稳定转染Flp-In-T-Rex HEK293细胞 | 第72-76页 |
| 3.3.3.1 多巴胺受体质粒稳定转染细胞后,Western blot检测结果 | 第72-74页 |
| 3.3.3.2 五羟色胺受体稳定细胞系的荧光检测 | 第74-75页 |
| 3.3.3.3 五羟色胺受体稳定细胞系的FRET检测 | 第75-76页 |
| 3.4 小结 | 第76-77页 |
| 3.5 讨论 | 第77-80页 |
| 第四章 食欲肽受体诱导表达稳定细胞株对化合物的筛选 | 第80-92页 |
| 4.1 实验材料 | 第80-83页 |
| 4.1.1 实验用细胞 | 第80页 |
| 4.1.2 实验仪器和设备 | 第80-81页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第81-83页 |
| 4.2 实验方法 | 第83-84页 |
| 4.2.1 细胞培养 | 第83页 |
| 4.2.2 细胞复苏 | 第83页 |
| 4.2.3 细胞传代 | 第83页 |
| 4.2.4 细胞冻存 | 第83页 |
| 4.2.5 细胞计数 | 第83页 |
| 4.2.6 western-blot实验 | 第83-84页 |
| 4.3 实验结果 | 第84-89页 |
| 4.3.1 用western-blot的方法检测诱导表达OX_2受体的稳定细胞株 | 第84-85页 |
| 4.3.2 食欲肽OX_2受体稳定细胞株对化合物活性进行筛选 | 第85-89页 |
| 4.3.2.1 用不同浓度激动剂处理后的PERK检测 | 第85-86页 |
| 4.3.2.2 用拮抗性化合物孵育后,激动剂处理后的PERK检测 | 第86-89页 |
| 4.4 小结 | 第89页 |
| 4.5 讨论 | 第89-92页 |
| 第五章 总结和展望 | 第92-94页 |
| 致谢 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-102页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 | 第102-104页 |
| 附录B OX2R编码基因序列 | 第104-106页 |
| 附录C D2编码基因序列 | 第106-108页 |
| 附录D D3编码基因序列 | 第108页 |
