| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-16页 |
| 1 引言 | 第16-25页 |
| ·几丁质 | 第16-17页 |
| ·几丁质的结构 | 第16页 |
| ·昆虫中几丁质的发现 | 第16-17页 |
| ·几丁质代谢相关酶 | 第17-18页 |
| ·几丁质合成及几丁质合成酶 | 第17页 |
| ·几丁质降解及几丁质降解酶 | 第17-18页 |
| ·应用及前景 | 第18-19页 |
| ·国内外研究现状 | 第19-23页 |
| ·昆虫几丁质代谢相关酶cDNA 的克隆 | 第19-21页 |
| ·昆虫几丁质代谢相关酶基因在虫体内的表达 | 第21-22页 |
| ·昆虫几丁质代谢相关酶基因的体外表达 | 第22页 |
| ·昆虫几丁质代谢相关酶的基因的拷贝数研究 | 第22-23页 |
| ·昆虫几丁质代谢相关酶的研究展望 | 第23页 |
| ·小地老虎介绍 | 第23-24页 |
| ·本论文研究的目的和意义 | 第24页 |
| ·研究目的 | 第24页 |
| ·研究意义 | 第24页 |
| ·本研究课题的来源及主要研究内容 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-42页 |
| ·材料 | 第25-26页 |
| ·菌株与质粒 | 第25页 |
| ·分子生物学用酶及试剂盒和各种试剂 | 第25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·仪器设备 | 第25页 |
| ·昆虫来源 | 第25-26页 |
| ·研究方法 | 第26-34页 |
| ·总RNA 提取 | 第26-27页 |
| ·提取过程 | 第26页 |
| ·所抽提的RNA 的质量检测 | 第26-27页 |
| ·RNA 的纯化 | 第27页 |
| ·利用RT-PCR 扩增保守区之间的cDNA 序列 | 第27-29页 |
| ·第一链cDNA 的合成 | 第27-28页 |
| ·PCR 反应 | 第28页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第28-29页 |
| ·DNA 回收 | 第29页 |
| ·连接反应 | 第29页 |
| ·JM109 感受态细胞制备 | 第29页 |
| ·E. coli 的转化 | 第29页 |
| ·RACE 引物设计 | 第29-31页 |
| ·几丁质合成酶RACE 引物设计 | 第29-30页 |
| ·几丁质酶RACE 引物设计 | 第30页 |
| ·β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶RACE 引物设计 | 第30-31页 |
| ·3′-RACE 的实验步骤 | 第31页 |
| ·5′-RACE 的实验步骤 | 第31-34页 |
| ·去磷酸化处理 | 第31页 |
| ·去帽子反应 | 第31-32页 |
| ·5′-RACE Adaptor 的连接 | 第32页 |
| ·反转录反应 | 第32-33页 |
| ·Outer PCR 反应 | 第33页 |
| ·Inner PCR 反应 | 第33-34页 |
| ·以下步骤与RT-PCR 扩增保守区之间的cDNA 序列的步骤相同 | 第34页 |
| ·全长cDNA 的获取及其序列分析 | 第34页 |
| ·cDNA 序列分析 | 第34-35页 |
| ·利用Blast 软件进行序列相似性检索 | 第34页 |
| ·分子质量、碱基组成、碱基分布 | 第34-35页 |
| ·全长cDNA 可读框架分析 | 第35页 |
| ·对ORF 进行限制性酶切分析 | 第35页 |
| ·核酸序列对齐分析的功能预测 | 第35页 |
| ·NCBI/Blast 软件的核酸序列同源性分析 | 第35页 |
| ·核酸序列之间的多重比对分析及进化分析 | 第35页 |
| ·蛋白质基本性质分析 | 第35页 |
| ·疏水性分析 | 第35页 |
| ·信号肽分析 | 第35页 |
| ·蛋白质功能预测 | 第35-36页 |
| ·蛋白质序列同源性分析及蛋白质功能预测 | 第35-36页 |
| ·结构位点、结构功能域数据库的蛋白质功能预测 | 第36页 |
| ·蛋白质结构预测 | 第36页 |
| ·蛋白质二级结构预测 | 第36页 |
| ·蛋白质三级结构预测 | 第36页 |
| ·不同生长发育时期几丁质代谢酶基因表达水平研究 | 第36-37页 |
| ·总RNA 的提取 | 第37页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第37页 |
| ·肌动蛋白全长基因的克隆与表达引物设计 | 第37页 |
| ·利用RT-PCR 扩增保守区之间的cDNA 序列 | 第37页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达研究 | 第37-42页 |
| ·几丁质酶基因cDNA 序列ORF 的PCR 反应 | 第37-38页 |
| ·PCR 产物酶切反应 | 第38页 |
| ·E.coli 质粒DNA 提取和酶切 | 第38页 |
| ·大肠杆菌表达载体构建 | 第38页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中诱导表达 | 第38-39页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第39-42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-75页 |
| ·几丁质代谢酶RNA 的提取 | 第42页 |
| ·RNA 完整性的检测 | 第42页 |
| ·纯度及产量检测 | 第42页 |
| ·RT-PCR 得到几丁质代谢酶的基因特异性片段及序列分析 | 第42-44页 |
| ·几丁质合成酶的基因特异性片段及序列分析 | 第42-43页 |
| ·几丁质酶的基因特异性片段及序列分析 | 第43页 |
| ·β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶的基因特异性片段及序列分析 | 第43-44页 |
| ·基因cDNA 序列的3’-RACE 结果 | 第44-45页 |
| ·几丁质酶基因cDNA 序列的3’-RACE 结果 | 第44页 |
| ·β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA 序列的3’-RACE 结果 | 第44-45页 |
| ·几丁质酶基因cDNA 序列的5’-RACE 结果 | 第45页 |
| ·基因cDNA 序列的获得 | 第45-50页 |
| ·几丁质合成酶基因cDNA 序列和氨基酸序列 | 第45-46页 |
| ·几丁质酶基因全长cDNA 序列和氨基酸序列 | 第46-48页 |
| ·β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA 序列和氨基酸序列 | 第48-50页 |
| ·三种几丁质代谢酶基因特征 | 第50-54页 |
| ·碱基序列组成分析 | 第50-52页 |
| ·氨基酸序列组成分析 | 第52-53页 |
| ·信号肽分析 | 第53-54页 |
| ·推导的氨基酸序列二级结构预测 | 第54页 |
| ·氨基酸结构域预测 | 第54-58页 |
| ·几丁质合成酶氨基酸结构域预测 | 第54-55页 |
| ·几丁质酶氨基酸结构域预测 | 第55-57页 |
| ·β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸结构域预测 | 第57-58页 |
| ·几丁质代谢酶氨基酸的疏水性分析 | 第58-60页 |
| ·序列同源性比较 | 第60-71页 |
| ·合成酶基因与其它几种鳞翅目昆虫的相应片段同源性比较 | 第60-61页 |
| ·几丁质酶基因与其它几种鳞翅目昆虫的同源性比较 | 第61-64页 |
| ·β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶基因与其它几种鳞翅目昆虫相应片段的同源性比较 | 第64-66页 |
| ·聚类分析 | 第66-71页 |
| ·克隆的合成酶基因与已发表的昆虫合成酶基因的聚类分析 | 第66-68页 |
| ·几丁质酶基因与已发表的昆虫几丁质酶基因的聚类分析 | 第68-71页 |
| ·克隆的β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶基因与已发表的其它几种鳞翅目昆虫相应片段的聚类分析 | 第71页 |
| ·小地老虎几丁质代谢酶基因表达水平研究 | 第71-74页 |
| ·肌动蛋白全长基因序列的获得与表达引物的设计 | 第71-73页 |
| ·不同发育时期的表达水平 | 第73-74页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第74-75页 |
| ·大肠杆菌重组表达载体的构建和鉴定 | 第74页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中的融合表达 | 第74-75页 |
| 4 讨论 | 第75-76页 |
| ·几丁质代谢酶基因拷贝数的探讨 | 第75页 |
| ·利用肌动蛋白进行RT-PCR 定性研究的探讨 | 第75页 |
| ·几丁质降解酶表达系统的选择 | 第75-76页 |
| 5 结论 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-81页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第81页 |
