| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 1 引言 | 第11-17页 |
| ·禽流感概述 | 第11页 |
| ·禽流感病毒基因组的分子生物学研究进展 | 第11-13页 |
| ·AIV的基因组 | 第11-12页 |
| ·AIV基因组编码蛋白的功能 | 第12-13页 |
| ·禽流感病毒NS1基因的研究进展 | 第13-14页 |
| ·禽流感抗体检测方法的研究进展 | 第14-15页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第15页 |
| ·研究目标 | 第15页 |
| ·技术路线 | 第15-17页 |
| 2 材料 | 第17-23页 |
| ·毒种 | 第17页 |
| ·载体与菌株 | 第17页 |
| ·克隆载体pMD18-T,表达载体pET-28a(+) | 第17页 |
| ·菌株 | 第17页 |
| ·主要试剂 | 第17-18页 |
| ·核酸的提取和PCR用试剂 | 第17页 |
| ·DNA克隆方面的所用的试剂 | 第17-18页 |
| ·主要酶类 | 第18页 |
| ·血清 | 第18页 |
| ·试验所用溶液及其配制 | 第18-21页 |
| ·抗生素类 | 第18页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备及转化所用溶液 | 第18页 |
| ·RNA提取所用溶液 | 第18-19页 |
| ·质粒DNA提取用溶液 | 第19页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所用溶液 | 第19-20页 |
| ·SDS-PAGE的相关溶液 | 第20页 |
| ·Western-blotting所用溶液的配制 | 第20页 |
| ·提取包涵体的相关溶液 | 第20-21页 |
| ·ELISA相关溶液的配制 | 第21页 |
| ·主要仪器设备 | 第21-23页 |
| 3 方法 | 第23-37页 |
| ·AIV的增殖及浓缩 | 第23页 |
| ·AIV总RNA的提取 | 第23页 |
| ·PCR引物的设计与合成 | 第23页 |
| ·NS1基因的扩增 | 第23-24页 |
| ·反转录AIV NS1-cDNA第一条链的合成 | 第24页 |
| ·PCR扩增NS1基因 | 第24页 |
| ·重组克隆质粒pT/NS1的构建 | 第24-27页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第24-25页 |
| ·重组克隆质粒的构建 | 第25-26页 |
| ·连接 | 第26页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第26页 |
| ·转化 | 第26页 |
| ·重组克隆质粒的小量制备——SDS碱裂解法 | 第26-27页 |
| ·重组克隆质粒的鉴定 | 第27-28页 |
| ·PCR鉴定 | 第27页 |
| ·酶切鉴定 | 第27-28页 |
| ·NS1基因的序列测定与分析 | 第28页 |
| ·重组表达载体pET/NS1的构建 | 第28-30页 |
| ·克隆质粒及表达载体的酶切 | 第28页 |
| ·目的基因和线性表达载体的电泳回收 | 第28-29页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第29页 |
| ·目的基因与表达载体的连接 | 第29-30页 |
| ·转化 | 第30页 |
| ·重组表达质粒的小量制备 | 第30页 |
| ·重组表达载体pET/NS1的鉴定 | 第30页 |
| ·PCR鉴定 | 第30页 |
| ·酶切鉴定 | 第30页 |
| ·重组NS1蛋白的诱导表达 | 第30-31页 |
| ·重组NS1蛋白的诱导表达与鉴定 | 第30-31页 |
| ·SDS-PAGE | 第31页 |
| ·重组NS1蛋白诱导表达的最佳条件的确定 | 第31-32页 |
| ·最佳诱导时间的确定 | 第31页 |
| ·最佳IPTG诱导浓度的确定 | 第31页 |
| ·重组NS1蛋白的大量诱导表达 | 第31-32页 |
| ·重组表达蛋白包涵体的制备 | 第32-33页 |
| ·菌体收集 | 第32页 |
| ·包涵体的破碎 | 第32页 |
| ·包涵体的洗涤 | 第32页 |
| ·包涵体的溶解 | 第32页 |
| ·包涵体的复性 | 第32-33页 |
| ·复性蛋白含量的测定及纯度鉴定 | 第33页 |
| ·纯化后重组蛋白活性的Western-blotting分析 | 第33-34页 |
| ·蛋白质的电转印 | 第33-34页 |
| ·免疫检测 | 第34页 |
| ·检测NS1蛋白抗体的间接ELISA方法的建立 | 第34-37页 |
| ·重组NS1蛋白抗原最适包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释度的确定 | 第34页 |
| ·重组NS1抗原包被条件的确定 | 第34页 |
| ·确定酶标二抗的作用时间 | 第34-35页 |
| ·确定底物显色时间 | 第35页 |
| ·NS1-ELISA方法的操作步骤 | 第35页 |
| ·ELISA阴阳性判定标准的确定 | 第35页 |
| ·敏感性试验 | 第35页 |
| ·特异性试验 | 第35-36页 |
| ·人工感染试验 | 第36-37页 |
| 4 结果 | 第37-54页 |
| ·NS1基因的RT-PCR扩增结果 | 第37页 |
| ·重组克隆质粒pT/NS1的鉴定 | 第37-38页 |
| ·PCR鉴定结果 | 第37-38页 |
| ·酶切鉴定结果 | 第38页 |
| ·NS1基因序列测定与分析 | 第38-45页 |
| ·NS1基因序列测定 | 第38-39页 |
| ·GD株NS1基因与其它毒株的核苷酸及其推导的氨基酸的序列比较结果 | 第39-43页 |
| ·GD株NS1基因的核苷酸及其推导的氨基酸同源性分析 | 第43-44页 |
| ·GD株NS1基因的进化分析 | 第44-45页 |
| ·重组表达载体pET/NS1的鉴定 | 第45-46页 |
| ·PCR鉴定 | 第45页 |
| ·酶切鉴定 | 第45-46页 |
| ·NS1基因的诱导表达 | 第46-47页 |
| ·诱导表达产物的鉴定 | 第46页 |
| ·诱导表达产物可溶性鉴定 | 第46-47页 |
| ·最佳诱导条件的确定 | 第47-48页 |
| ·最佳诱导时间的确定 | 第47页 |
| ·最佳诱导浓度的确定 | 第47-48页 |
| ·重组蛋白包涵体的纯化及鉴定 | 第48-49页 |
| ·纯化后重组蛋白活性的鉴定 | 第49-50页 |
| ·检测NS1蛋白抗体的ELISA方法的建立及初步应用 | 第50-54页 |
| ·重组NS1蛋白抗原最适包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定 | 第50-51页 |
| ·包被条件的确定 | 第51页 |
| ·酶标二抗时间的确定 | 第51页 |
| ·底物显色时间的确定 | 第51-52页 |
| ·间接ELISA检测方法基本程序的确定 | 第52页 |
| ·NS1-ELISA阴阳性界限的确定 | 第52页 |
| ·敏感性试验 | 第52-53页 |
| ·NS1-ELISA特异性试验 | 第53页 |
| ·人工感染试验 | 第53-54页 |
| 5 讨论 | 第54-59页 |
| ·关于对NS1蛋白功能的研究和利用 | 第54页 |
| ·H5N1 AIV基因组RNA的提取 | 第54页 |
| ·GD株NS1基因的序列分析 | 第54页 |
| ·NS1基因表达载体的选择 | 第54-55页 |
| ·培养条件的优化 | 第55页 |
| ·包涵体蛋白的提取与纯化 | 第55-56页 |
| ·包涵体的分离 | 第55-56页 |
| ·包涵体的洗涤与溶解 | 第56页 |
| ·包涵体的复性 | 第56页 |
| ·免疫印记检测 | 第56-57页 |
| ·ELISA的影响因素 | 第57页 |
| ·ELISA方法的判断标准 | 第57页 |
| ·关于NS1抗体的探讨 | 第57页 |
| ·NS1-ELISA检测方法的应用前景 | 第57-59页 |
| 6 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第67-68页 |
| 作者简历 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 附录 | 第70-74页 |
