| 中文摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 第一章 引言 | 第14-37页 |
| 1 α-半乳糖苷酶及其分子生物学的研究进展 | 第14-24页 |
| ·α-半乳糖苷酶的来源 | 第14页 |
| ·α-半乳糖苷酶的生理功能 | 第14-15页 |
| ·α-半乳糖苷酶的分类 | 第15-17页 |
| ·α-半乳糖苷酶的生化性质 | 第17-18页 |
| ·α-半乳糖苷酶的基因工程 | 第18-21页 |
| ·α-半乳糖苷酶的表达与调控 | 第21-22页 |
| ·α-半乳糖苷酶的结构和功能研究 | 第22-24页 |
| 2 α-半乳糖苷酶的应用领域与应用前景 | 第24-27页 |
| ·饲料工业 | 第24-26页 |
| ·食品工业 | 第26页 |
| ·造纸工业 | 第26-27页 |
| ·医疗领域 | 第27页 |
| 3 真核生物的表达系统 | 第27-36页 |
| ·啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统 | 第28页 |
| ·甲醇营养型酵母表达系统 | 第28-34页 |
| ·多形汉逊酵母表达系统 | 第28-29页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第29-34页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统在在饲料添加剂开发上的应用 | 第34-36页 |
| ·饲料用酶 | 第34-35页 |
| ·激素 | 第35页 |
| ·抗菌肽 | 第35-36页 |
| 研究的目的和意义 | 第36-37页 |
| 第二章 一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质 | 第37-53页 |
| 1 材料和方法 | 第37-42页 |
| ·材料 | 第37页 |
| ·菌株 | 第37页 |
| ·试剂和仪器 | 第37页 |
| ·培养基和培养条件 | 第37页 |
| ·酶活性测定 | 第37页 |
| ·蛋白质浓度和分子量的测定 | 第37-38页 |
| ·酶的分离纯化 | 第38页 |
| ·离子交换层析 | 第38页 |
| ·凝胶过滤层析 | 第38页 |
| ·电泳 | 第38-40页 |
| ·SDS-PAGE | 第38-39页 |
| ·非变性PAGE | 第39页 |
| ·活性染色 | 第39-40页 |
| ·非变性梯度凝胶电泳 | 第40页 |
| ·α-半乳糖苷酶转PVDF膜 | 第40页 |
| ·纯化蛋白的质谱鉴定与内肽序列的测定 | 第40页 |
| ·酶学性质 | 第40-42页 |
| ·α-半乳糖苷酶的最适pH和pH稳定性的测定 | 第40-41页 |
| ·α-半乳糖苷酶的反应最适温度及热稳定性 | 第41页 |
| ·不同金属离子及相关化学试剂对α-半乳糖苷酶的影响 | 第41页 |
| ·α-半乳糖苷酶反应初速度和K_m及V_(max)的测定 | 第41页 |
| ·α-半乳糖苷酶比活性测定 | 第41-42页 |
| ·底物特异性的测定 | 第42页 |
| 2 结果与分析 | 第42-52页 |
| ·青霉F63α-半乳糖苷酶的活性染色 | 第42-43页 |
| ·来源于青霉的α-半乳糖苷酶Agl1的纯化 | 第43-45页 |
| ·α-半乳糖苷酶的N端测序 | 第45页 |
| ·纯化蛋白的内肽序列的测定 | 第45-46页 |
| ·α-半乳糖苷酶的酶学性质 | 第46-52页 |
| ·α-半乳糖苷酶活性的测定 | 第46页 |
| ·α-半乳糖苷酶的酶学性质 | 第46-52页 |
| 本章小结 | 第52-53页 |
| 第三章 α-半乳糖苷酶基因的克隆 | 第53-70页 |
| 1 材料和方法 | 第53-59页 |
| ·材料 | 第53页 |
| ·菌株和质粒 | 第53页 |
| ·引物合成 | 第53页 |
| ·试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第53页 |
| ·方法 | 第53-59页 |
| ·青霉F63基因组DNA的提取 | 第53-54页 |
| ·α-半乳糖苷酶基因组DNA片段的扩增 | 第54页 |
| ·反向PCR | 第54-55页 |
| ·α-半乳糖苷酶全长cDNA的获得 | 第55-56页 |
| ·双酶切 | 第56页 |
| ·DNA电泳回收 | 第56-57页 |
| ·连接 | 第57页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第57页 |
| ·电转化 | 第57-58页 |
| ·筛选重组子 | 第58页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第58-59页 |
| ·α-半乳糖苷酶DNA及cDNA序列测定、序列一致性比较 | 第59页 |
| 2 结果 | 第59-69页 |
| ·获得α-半乳糖苷酶基因的部分序列 | 第59-60页 |
| ·反向PCR | 第60-62页 |
| ·α-半乳糖苷酶基因cDNA的克隆及鉴定 | 第62-64页 |
| ·青霉F63 α-半乳糖苷酶基因组DNA、cDNA及衍生的氨基酸序列分析 | 第64-65页 |
| ·青霉α-半乳糖苷酶起始密码子的推断 | 第65-66页 |
| ·青霉F63 α-半乳糖苷酶的序列一致性分析 | 第66-69页 |
| 本章小结 | 第69-70页 |
| 第四章 α-半乳糖苷酶基因的异源表达 | 第70-80页 |
| 1 材料和方法 | 第70-74页 |
| ·材料 | 第70-71页 |
| ·菌株与质粒 | 第70页 |
| ·引物合成 | 第70页 |
| ·培养基 | 第70页 |
| ·试剂及仪器 | 第70-71页 |
| ·方法 | 第71-74页 |
| ·α-半乳糖苷酶的重组菌株的构建 | 第71页 |
| ·α-半乳糖苷酶基因信号肽编码序列的去除 | 第71-72页 |
| ·真核重组表达载体的构建 | 第72页 |
| ·质粒DNA的处理 | 第72页 |
| ·酵母感受态的制备 | 第72-73页 |
| ·酵母细胞的转化 | 第73页 |
| ·转化子的筛选 | 第73页 |
| ·目的基因在毕赤酵母中的表达检测 | 第73-74页 |
| ·发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵 | 第74页 |
| 2 结果 | 第74-79页 |
| ·表达载体的构建和重组质粒的转化 | 第74-75页 |
| ·表达α-半乳糖苷酶的阳性重组子的筛选 | 第75-76页 |
| ·摇瓶水平α-半乳糖苷酶的表达 | 第76页 |
| ·重组子的PCR检测 | 第76-77页 |
| ·发酵罐水平α-半乳糖苷酶的表达 | 第77-79页 |
| 本章小结 | 第79-80页 |
| 第五章 重组与天然α-半乳糖酶的酶学性质比较 | 第80-92页 |
| 1 材料和方法 | 第80-81页 |
| ·试验材料 | 第80页 |
| ·实验仪器 | 第80页 |
| ·重组α-半乳糖酶的纯化 | 第80-81页 |
| ·粗酶液的制备 | 第80页 |
| ·HiTrap Q Sepharose XL层析 | 第80页 |
| ·Sephacryl S-200分子筛层析 | 第80-81页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第81页 |
| ·电泳 | 第81页 |
| ·表达产物的脱糖基化 | 第81页 |
| ·α-半乳糖酶的酶学性质的研究 | 第81页 |
| 2 结果 | 第81-91页 |
| ·重组α-半乳糖苷酶的纯化 | 第81-84页 |
| ·天然和重组α-半乳糖苷酶的酶学性质比较 | 第84-91页 |
| ·α-半乳糖苷酶的最适作用pH和pH稳定性 | 第84-85页 |
| ·α-半乳糖苷酶的最适作用温度和热稳定性 | 第85-86页 |
| ·重组α-半乳糖苷酶的K_m值和最大反应速度V_(max) | 第86-87页 |
| ·不同化学试剂对天然和重组α-半乳糖苷酶酶活的影响 | 第87-88页 |
| ·天然和重组α-半乳糖苷酶的底物特异性 | 第88-90页 |
| ·重组α-半乳糖苷酶与天然α-半乳糖苷酶的酶学性质的比较 | 第90-91页 |
| 本章小结 | 第91-92页 |
| 第六章 讨论 | 第92-95页 |
| 第七章 结论 | 第95-97页 |
| 参考文献 | 第97-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 作者简介 | 第107页 |
