| 中文摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-14页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 鸭疫里默氏杆菌病的研究进展 | 第15-27页 |
| 1 概述 | 第15-16页 |
| 2 病原学 | 第16-20页 |
| ·分类地位 | 第16-17页 |
| ·血清型 | 第17-19页 |
| ·血清亚型 | 第19-20页 |
| 3 诊断 | 第20-21页 |
| 4 免疫原性研究 | 第21-22页 |
| 5 致病因子研究 | 第22-23页 |
| 6 耐药性的研究 | 第23页 |
| 7 疫苗研究 | 第23-27页 |
| ·灭活苗的研究 | 第23-25页 |
| ·弱毒苗的研究 | 第25页 |
| ·亚单位疫苗的研究 | 第25-27页 |
| 第二章 cDNA文库构建技术及其筛选策略 | 第27-35页 |
| 1 构建cDNA文库的基本原理及主要步骤 | 第27-28页 |
| ·基本原理 | 第27页 |
| ·主要步骤 | 第27-28页 |
| 2 cDNA全长文库的构建 | 第28页 |
| 3 均一化cDNA文库 | 第28-30页 |
| 4 差减cDNA文库 | 第30页 |
| 5 固相cDNA文库(solid-phase cDNA library) | 第30-31页 |
| 6 cDNA文库的筛选策略 | 第31-33页 |
| ·从非全长cDNA文库中筛选新基因 | 第31-33页 |
| ·从全长cDNA文库中进行杂交筛选 | 第33页 |
| 7 小结 | 第33-35页 |
| 第三章 血清1型鸭疫里默氏杆菌基因文库的构建及鉴定 | 第35-47页 |
| 1 材料 | 第35-36页 |
| ·菌株和载体 | 第35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35-36页 |
| ·主要试剂 | 第36页 |
| ·其它材料 | 第36页 |
| 2 方法 | 第36-41页 |
| ·细菌培养及基因组DNA的提取 | 第36-37页 |
| ·基因组DNA的部分酶切及回收 | 第37-39页 |
| ·连接 | 第39页 |
| ·包装 | 第39页 |
| ·滴定 | 第39-40页 |
| ·蓝白斑计数 | 第40页 |
| ·文库的扩增与贮存 | 第40-41页 |
| 3 结果 | 第41-44页 |
| ·RA基因组DNA的完整性及纯度 | 第41-42页 |
| ·基因组DNA部分酶切片段的制备 | 第42-43页 |
| ·RA基因组文库的建立 | 第43页 |
| ·蓝白斑计数 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-46页 |
| ·基因组DNA的完整性 | 第44页 |
| ·构建文库载体的选择 | 第44-45页 |
| ·限制性内切酶的选择及酶切条件的优化 | 第45页 |
| ·基因组文库的鉴定 | 第45-46页 |
| 5 小结 | 第46-47页 |
| 第四章 血清1型鸭疫里默氏杆菌基因文库的免疫筛选 | 第47-59页 |
| 1 材料 | 第47-48页 |
| ·菌株及基因组文库 | 第47页 |
| ·Lambda DNA及限制性内切酶 | 第47页 |
| ·试验动物 | 第47-48页 |
| ·主要试剂 | 第48页 |
| ·主要仪器 | 第48页 |
| ·其它材料 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-54页 |
| ·血清1型RA抗血清的制备 | 第48-49页 |
| ·抗血清的预处理 | 第49-50页 |
| ·一抗浓度的确定—斑点印迹试验 | 第50-51页 |
| ·文库的免疫筛选 | 第51-53页 |
| ·阳性斑的体内删除(in vivo excision) | 第53-54页 |
| 3 结果 | 第54-56页 |
| ·RA抗血清的制备及吸附处理 | 第54页 |
| ·一抗浓度的确定 | 第54页 |
| ·阳性噬菌斑的筛选及纯化 | 第54-55页 |
| ·阳性斑的酶切鉴定及测序结果 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-57页 |
| ·筛选条件的优化 | 第56-57页 |
| ·阳性斑的体内删除及酶切鉴定 | 第57页 |
| 5 小结 | 第57-59页 |
| 第五章 序列的生物信息学分析 | 第59-81页 |
| 1 序列载体污染分析 | 第59页 |
| 2 序列相似性搜索 | 第59-60页 |
| 3 ORF(Open Reading Frame)预测 | 第60-61页 |
| 4 采用NCBI的BLASTP 2.2.13工具对各个ORF进行逐一分析 | 第61-65页 |
| ·ORF2141 | 第61-62页 |
| ·ORF2076 | 第62页 |
| ·ORF1155 | 第62-64页 |
| ·ORF1110 | 第64页 |
| ·ORF1104 | 第64-65页 |
| 5 采用FASTA程序进一步分析 | 第65-67页 |
| ·ORF2141 | 第65-66页 |
| ·ORF1155 | 第66页 |
| ·ORF1110 | 第66-67页 |
| 6 基因预测 | 第67-68页 |
| ·GeneMark hmm2.0程序在线预测 | 第67页 |
| ·FgenesB程序在线预测 | 第67页 |
| ·RBS的确定 | 第67-68页 |
| 7 蛋白质序列分析 | 第68-72页 |
| ·ORF1155 | 第68-70页 |
| ·ORF1110 | 第70-72页 |
| 8 分别采用软件ANTHEPROT v5.0和Lasergene7进行抗原性分析 | 第72-73页 |
| ·ORF1155 | 第72-73页 |
| ·ORF1110 | 第73页 |
| 9 结果和讨论 | 第73-78页 |
| ·原始序列中载体污染的判定 | 第74页 |
| ·序列相似性搜索 | 第74-75页 |
| ·ORF预测 | 第75-76页 |
| ·基因预测 | 第76页 |
| ·蛋白质序列结构与功能预测 | 第76-77页 |
| ·亚细胞定位 | 第77页 |
| ·跨膜区预测 | 第77-78页 |
| ·疏水性分析 | 第78页 |
| ·抗原性预测 | 第78页 |
| 10 小结 | 第78-81页 |
| 第六章 原核表达质粒pET32-CPEP的构建与表达 | 第81-99页 |
| 1 材料 | 第81-82页 |
| ·菌株及表达载体 | 第81页 |
| ·主要仪器 | 第81-82页 |
| ·主要试剂 | 第82页 |
| ·其它 | 第82页 |
| 2 方法 | 第82-88页 |
| ·表达用引物的设计与合成 | 第82-83页 |
| ·表达用引物的PCR及测序鉴定 | 第83页 |
| ·PCR产物的鉴定 | 第83页 |
| ·插入片段的制备 | 第83-84页 |
| ·连接载体pET-32c的制备 | 第84页 |
| ·原核表达质粒的构建 | 第84页 |
| ·连接产物转化克隆菌株DH_(5α) | 第84-85页 |
| ·转化表达菌株BL21(DE3) | 第85页 |
| ·诱导表达 | 第85页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第85-86页 |
| ·免疫印迹检测 | 第86-87页 |
| ·表达蛋白的可溶性和不可溶性分析 | 第87页 |
| ·表达条件的优化 | 第87-88页 |
| 3 结果 | 第88-92页 |
| ·PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定 | 第88页 |
| ·T载体克隆及测序鉴定 | 第88页 |
| ·原核表达质粒的构建及鉴定 | 第88-89页 |
| ·诱导表达 | 第89-90页 |
| ·免疫印迹结果 | 第90页 |
| ·重组表达蛋白的可溶性和不可溶性分析 | 第90-91页 |
| ·表达条件的优化 | 第91-92页 |
| 4 讨论 | 第92-97页 |
| ·表达用引物的设计 | 第92页 |
| ·T载体克隆 | 第92-93页 |
| ·诱导表达 | 第93-95页 |
| ·重组表达蛋白的可溶性分析 | 第95-96页 |
| ·表达条件的优化 | 第96页 |
| ·免疫印迹检测 | 第96-97页 |
| 5 小结 | 第97-99页 |
| 第七章 表达产物的纯化及其免疫原性研究 | 第99-107页 |
| 1 材料 | 第99-100页 |
| ·试验动物 | 第99页 |
| ·主要仪器设备 | 第99页 |
| ·主要试剂 | 第99页 |
| ·其它材料 | 第99-100页 |
| 2 方法 | 第100-102页 |
| ·表达产物的纯化 | 第100-101页 |
| ·重组表达蛋白的免疫原性研究 | 第101-102页 |
| 3 结果 | 第102-104页 |
| ·重组表达蛋白过柱纯化效果 | 第102-103页 |
| ·重组表达蛋白的免疫印迹结果 | 第103-104页 |
| 4 讨论 | 第104-105页 |
| ·表达产物的纯化 | 第104页 |
| ·重组蛋白的免疫原性 | 第104-105页 |
| 5 小结 | 第105-107页 |
| 第八章 基于荚膜多糖输出蛋白基因的PCR检测鸭疫里默氏杆菌病 | 第107-115页 |
| 1 材料 | 第107-108页 |
| ·参考菌株 | 第107页 |
| ·主要试剂和培养基 | 第107-108页 |
| ·主要仪器 | 第108页 |
| ·试验动物 | 第108页 |
| ·其它 | 第108页 |
| 2 方法 | 第108-110页 |
| ·检测引物的设计与合成 | 第108页 |
| ·基因组DNA模板的制备 | 第108页 |
| ·菌落提取液模板的制备 | 第108-109页 |
| ·PCR扩增及条件优化 | 第109页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 | 第109页 |
| ·特异性实验 | 第109页 |
| ·敏感性检测 | 第109-110页 |
| ·重复性实验 | 第110页 |
| ·临床初步检测 | 第110页 |
| 3 结果 | 第110-112页 |
| ·引物BLAST结果 | 第110页 |
| ·PCR条件的优化 | 第110页 |
| ·特异性实验 | 第110-111页 |
| ·敏感性检测 | 第111页 |
| ·重复性实验 | 第111-112页 |
| ·临床初步检测 | 第112页 |
| 4 讨论 | 第112-114页 |
| ·PCR方法的建立 | 第112-113页 |
| ·PCR条件的优化 | 第113页 |
| ·PCR方法与现有检测鸭疫里默氏杆菌病的比较 | 第113-114页 |
| 5 小结 | 第114-115页 |
| 第九章 结论 | 第115-117页 |
| 参考文献 | 第117-131页 |
| 附录一 载体图谱 | 第131-135页 |
| 附录二 测序图谱 | 第135-143页 |
| 1 含插入DNA片段的pBK-CMV测序图谱，共9个反应 | 第135-140页 |
| 2 PCR产物测序鉴定，共1个反应 | 第140-141页 |
| 3 T载体克隆后测序鉴定，共2个反应 | 第141-143页 |
| 附录三 培养基及主要试剂溶液的配制 | 第143-147页 |
| 附录四 试剂盒使用说明 | 第147-149页 |
| 附录五 生物信息学在线分析相关网址 | 第149-151页 |
| 附录六 图表目录 | 第151-154页 |
| 致谢 | 第154-155页 |
| 作者简介 | 第155-156页 |
| 后记 | 第156页 |
