| 目录 | 第1-9页 |
| 摘要 氨基酰-tRNA 合成酶研究/戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的蛋白质工程 | 第9-13页 |
| ABSTRACTThe study of aminoacyl-tRNA synthetase/Protein engineer ofglutaryl 7-amino-cephalosporin acid acylase | 第13-17页 |
| 第一部分 氨基酰-tRNA 合成酶研究 | 第17-94页 |
| 第一章 精氨酰-tRNA 合成酶研究 | 第17-42页 |
| 第一节 不同的翻译起始产生两种人胞质精氨酰-tRNA 合成酶 | 第17-32页 |
| 摘要 | 第17页 |
| 关键词 | 第17-18页 |
| 1 引言 | 第18-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-24页 |
| ·质粒菌株和细胞株 | 第21-22页 |
| ·材料 | 第22页 |
| ·定点诱变和质粒构建 | 第22-23页 |
| ·蛋白质表达和纯化 | 第23-24页 |
| ·细胞培养和转染 | 第24页 |
| ·Western印迹实验 | 第24页 |
| 3 结果和讨论 | 第24-29页 |
| ·人胞质ArgRS的表达和纯化 | 第25-26页 |
| ·人细胞内也存在两种形式的胞质ArgRS | 第26-27页 |
| ·不同的翻译起始产生了两种形式的人胞质ArgRS | 第27-29页 |
| 参考文献 | 第29-32页 |
| 第二节 刀豆氨酸对精氨酰-tRNA合成酶的抑制动力学研究 | 第32-42页 |
| 摘要 | 第32页 |
| 关键词 | 第32页 |
| 1 引言 | 第32-33页 |
| 2 材料和方法 | 第33-35页 |
| ·材料 | 第33-34页 |
| ·菌种和质粒 | 第34页 |
| ·大肠杆菌tRNAArg的制备 | 第34页 |
| ·蛋白质表达和纯化 | 第34-35页 |
| ·刀豆氨酸抑制不同来源ArgRS的抑制动力学分析 | 第35页 |
| 3 结果和讨论 | 第35-41页 |
| ·大肠杆菌酿酒酵母和人胞质ArgRS的对精氨酸动力学常数的比较 | 第35-36页 |
| ·刀豆氨酸对大肠杆菌酿酒酵母和人胞质ArgRS的抑制动力学 | 第36-39页 |
| ·构建三级结构模型比较这三种ArgRS活性中心的结构差别 | 第39-41页 |
| 参考文献 | 第41-42页 |
| 第二章 超耐热菌Aquifexaeolicus亮氨酰-tRNA合成酶对亮氨酸tRNA的识别 | 第42-94页 |
| 第一节 用酵母三杂交筛选研究超耐热菌Aquifexaeolicus亮氨酰-tRNA合成酶β-亚基的两个tRNA识别结构域 | 第42-69页 |
| 摘要 | 第42页 |
| 关键词 | 第42-43页 |
| 1 引言 | 第43-45页 |
| 2 材料和方法 | 第45-50页 |
| ·材料 | 第45页 |
| ·质粒和菌株 | 第45-46页 |
| ·酵母三杂交系统的构建 | 第46-47页 |
| ·A.aeolicusαβ-LeuRS及其β-亚基的表达和纯化 | 第47-48页 |
| ·凝胶阻滞方法分析A.aeolicusαβ-LeuRS及其β-亚基的tRNA结合能力 | 第48-49页 |
| ·动力学分析 | 第49页 |
| ·编校功能分析 | 第49-50页 |
| 3 结果 | 第50-60页 |
| ·在A.aeolicusαβ-LeuRS的β-subunit与它对应tRNALeu相互作用的基础上构建酵母三杂交系统 | 第50-52页 |
| ·利用酵母三杂交系统筛选tRNA结合能力受损的β-亚基突变体 | 第52-53页 |
| ·利用三杂交体系中分析构建的β-亚基的定点突变体与tRNALeu的结合 | 第53-55页 |
| ·β-亚基以及αβ-LeuRS的tRNA亲和力分析 | 第55-57页 |
| ·动力学分析αβ-LeuRS突变体 | 第57-59页 |
| ·突变Q269stop影响了酶的编校能力 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 第二节 Aquifexaeolicusαβ-LeuRS的β-亚基上的不变残基Pro77和Asn152参与tRNALeuD-茎环的识别 | 第69-83页 |
| 摘要 | 第69页 |
| 关键词 | 第69页 |
| 1 引言 | 第69-71页 |
| 2 材料和方法 | 第71-74页 |
| ·材料 | 第71页 |
| ·质粒和菌种 | 第71页 |
| ·RNA制备 | 第71-73页 |
| ·蛋白质表达和纯化 | 第73页 |
| ·凝胶阻滞分析 | 第73-74页 |
| ·氨基酰化反应测定 | 第74页 |
| 3 结果 | 第74-79页 |
| ·保守残基P77的突变影响氨基酰化反应的过渡态而非基态 | 第74-77页 |
| ·突变N152A和P77G均不影响酶催化氨基酰化小螺旋的能力 | 第77页 |
| ·αβ-LeuRSN152A和P77G变种酶催化一个由小螺旋D-茎环二者组成的底物tRNALeuACVL氨基酰化能力受损 | 第77-79页 |
| 4 讨论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-83页 |
| 第三节 用足迹实验研究超耐热菌AquifexaeolicustRNALeu被亮氨酰-tRNA合成酶的识别 | 第83-94页 |
| 摘要 | 第83页 |
| 关键词 | 第83页 |
| 1 引言 | 第83-84页 |
| 2 材料和方法 | 第84-87页 |
| ·材料 | 第85页 |
| ·含有硫代磷酸酯键的tRNA转录本的制备 | 第85页 |
| ·氨基酰化反应测定 | 第85-86页 |
| ·P标记tRNA转录本 | 第86页 |
| ·凝胶阻滞分析标记过的转录本与αβ-LeuRS的结合 | 第86页 |
| ·RNA足迹实验 | 第86-87页 |
| 3 实验结果 | 第87-89页 |
| ·硫代磷酸酯标记的tRNALeu制备及其质量 | 第87页 |
| ·tRNA与LeuRS结合 | 第87-88页 |
| ·RNA足迹实验发现αβ-LeuRS保护tRNA的D-茎和反密码茎 | 第88-89页 |
| 4 讨论 | 第89-92页 |
| 参考文献 | 第92-94页 |
| 第二部分戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因在大肠杆菌中的分泌表达 | 第94-105页 |
| 摘要 | 第94页 |
| 关键词 | 第94页 |
| 1 引言 | 第94-96页 |
| 2 材料和方法 | 第96-99页 |
| ·菌株和质粒 | 第96页 |
| ·质粒pETCA1S和pSuperCA1S的构建 | 第96-98页 |
| ·酶活力分析 | 第98页 |
| ·工程菌的培养和菌体收集 | 第98-99页 |
| ·细胞分级 | 第99页 |
| ·优化培养条件 | 第99页 |
| 3 实验结果 | 第99-103页 |
| ·分泌表达质粒pETCA1S和pSuperCA1S的构建 | 第99-100页 |
| ·GL-7-ACA酰化酶在转化子中的高分泌表达 | 第100-101页 |
| ·培养基温度和pH值对GL-7-ACA酰化酶 | 第101-102页 |
| ·转化子的比活力 | 第102-103页 |
| ·转化子的稳定性 | 第103页 |
| 4 讨论 | 第103-105页 |
| 参考文献 | 第105-107页 |
| 结论 | 第107-109页 |
| 在学期间发表论文 | 第109-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
