| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 第一章 综述 | 第15-43页 |
| 1 酸性蛋白酶 | 第15-24页 |
| ·酸性蛋白酶的来源 | 第15-16页 |
| ·酸性蛋白酶的酶学性质 | 第16-18页 |
| ·酸性蛋白酶的最适作用pH及pH稳定性 | 第16页 |
| ·酸性蛋白酶的最适作用温度及温度适应性 | 第16-17页 |
| ·酸性蛋白酶的抑制剂 | 第17页 |
| ·金属离子对酸性蛋白酶的影晌 | 第17-18页 |
| ·产酸性蛋白酶的微生物 | 第18页 |
| ·酸性蛋白酶的分类 | 第18页 |
| ·酸性蛋白酶的应用 | 第18-21页 |
| ·酸性蛋白酶在皮革工业中的应用 | 第18-19页 |
| ·酸性蛋白酶在食品工业中的应用 | 第19-20页 |
| ·酸性蛋白酶在畜牧业中的应用 | 第20-21页 |
| ·酸性蛋白酶在医疗方面的应用 | 第21页 |
| ·国内外酸性蛋白酶的研究进展 | 第21-24页 |
| ·酸性蛋白酶菌种选育 | 第21-23页 |
| ·酸性蛋白酶分子生物学方面的研究进展 | 第23-24页 |
| 2 GPI锚定蛋白简介 | 第24-29页 |
| ·GPI锚定蛋白的结构特点 | 第26页 |
| ·酵母菌中GPI锚的合成及相关过程酶的基因 | 第26-27页 |
| ·GPI锚的功能 | 第27-28页 |
| ·GPI的膜整合特性 | 第27页 |
| ·GPI与细胞信号的传递 | 第27-28页 |
| ·GPI与锚定蛋白之间的连接 | 第28页 |
| ·基于GPI锚定原理的表面展示系统 | 第28-29页 |
| 3 海洋酵母菌资源及应用简介 | 第29-41页 |
| ·海洋酵母的定义 | 第29-30页 |
| ·海洋酵母种类与分布 | 第30-33页 |
| ·河口和红树林地区 | 第31页 |
| ·大洋水体和深海沉积物 | 第31-33页 |
| ·海洋酵母研究进展及意义 | 第33-41页 |
| ·海洋酵母合成丰富的活性物质 | 第33-39页 |
| ·海洋酵母菌降解环境污染物 | 第39-40页 |
| ·海洋酵母菌适应极端环境 | 第40-41页 |
| 4 论文的研究目的与意义 | 第41-43页 |
| 第二章 产酸性蛋白酶海洋酵母菌的筛选及鉴定 | 第43-55页 |
| 1 前言 | 第43-44页 |
| 2 实验材料和方法 | 第44-50页 |
| ·实验材料 | 第44-45页 |
| ·试剂 | 第44页 |
| ·培养基 | 第44-45页 |
| ·实验方法 | 第45-50页 |
| ·样品来源 | 第45页 |
| ·海洋酵母的分离 | 第45页 |
| ·产酸性蛋白酶海洋酵母菌的初筛 | 第45页 |
| ·产酸性蛋白酶菌株的复筛 | 第45页 |
| ·考马斯亮蓝法测定总蛋白的含量 | 第45-47页 |
| ·酸性蛋白酶活测定方法 | 第47页 |
| ·产酸性蛋白酶海洋酵母的菌种鉴定 | 第47-50页 |
| 3 实验结果 | 第50-54页 |
| ·菌株初筛结果 | 第50-51页 |
| ·菌株复筛结果 | 第51页 |
| ·菌株鉴定结果 | 第51-54页 |
| ·酵母菌常规形态特征和生理生化反应实验结果 | 第51-52页 |
| ·酵母菌W6b分子生物学鉴定实验结果 | 第52-54页 |
| 4 讨论 | 第54页 |
| 5 本章小结 | 第54-55页 |
| 第三章 W6b产酸性蛋白酶的培养条件优化 | 第55-68页 |
| 1 引言 | 第55页 |
| 2 材料与方法 | 第55-56页 |
| ·菌种来源 | 第55页 |
| ·培养基 | 第55页 |
| ·培养条件 | 第55页 |
| ·细胞生长量的测定 | 第55-56页 |
| ·酸性蛋白酶活力的测定 | 第56页 |
| ·酶的最适反应温度 | 第56页 |
| ·酶的最适作用pH | 第56页 |
| 3 结果与讨论 | 第56-67页 |
| ·酸性蛋白酶粗酶的最适作用温度 | 第56页 |
| ·酸性蛋白酶粗酶的最适作用pH | 第56-57页 |
| ·培养条件的优化 | 第57-61页 |
| ·不同培养起始pH对产酶和细胞生长的影响 | 第57-58页 |
| ·不同培养温度对产酶和细胞生长的影响 | 第58-60页 |
| ·不同摇床转速对W6b产酶和细胞生长的影响 | 第60页 |
| ·接种量对W6b产酸性蛋白酶和细胞生长的影响 | 第60-61页 |
| ·培养基组分的优化 | 第61-66页 |
| ·不同碳源对产酶的影响 | 第61-63页 |
| ·不同氮源对产酶和细胞生长的影响 | 第63-64页 |
| ·不同浓度的葡萄糖对产酶的影响 | 第64-65页 |
| ·不同浓度的酪蛋白对产酶的影响 | 第65页 |
| ·不同浓度的酵母提取物对W6b产酶的影响 | 第65-66页 |
| ·W6b菌在优化的培养条件下的生长和产酶过程曲线 | 第66-67页 |
| 4 本章小结 | 第67-68页 |
| 第四章 酸性蛋白酶的基因克隆 | 第68-96页 |
| 1 前言 | 第68-69页 |
| 第一节 简并PCR扩增W6b酸性蛋白酶的保守序列 | 第69-78页 |
| 1 材料 | 第69-70页 |
| ·菌株和质粒 | 第69页 |
| ·试剂 | 第69页 |
| ·培养基 | 第69页 |
| ·缓冲液及抗生素 | 第69-70页 |
| 2 方法 | 第70-74页 |
| ·海洋酵母W6b基因组DNA的提取 | 第70页 |
| ·简并引物的设计 | 第70页 |
| ·简并PCR扩增 | 第70-71页 |
| ·PCR结果观察 | 第71页 |
| ·PCR产物的回收 | 第71页 |
| ·PCR产物与T载体连接 | 第71-72页 |
| ·CaCl_2制备大肠杆菌感受态的制备 | 第72页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第72-73页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第73页 |
| ·质粒提取 | 第73页 |
| ·阳性克隆质粒的酶切验证 | 第73页 |
| ·目的片断测序和比对 | 第73-74页 |
| 3 结果和讨论 | 第74-78页 |
| ·简并PCR引物的设计 | 第74-75页 |
| ·简并PCR克隆酸性蛋酶SAP6部分基因 | 第75-78页 |
| ·海洋酵母M.reukaufii W6b基因组DNA的提取 | 第75页 |
| ·简并引物PCR | 第75-77页 |
| ·简并引物PCR结果 | 第77-78页 |
| 第二节 SMART RACE PCR扩增酸性蛋白酶全长序列 | 第78-95页 |
| 1 材料 | 第78页 |
| 2 方法 | 第78-82页 |
| ·海洋酵母M.reukaufii W6b RNA的提取 | 第78-79页 |
| ·引物设计 | 第79页 |
| ·3'-cDNA和5'-cDNA第一链的合成 | 第79页 |
| ·3'-RACE及5'-RACE获得全长cDNA | 第79-81页 |
| ·酸性蛋白酶基因SAP6全长cDNA的获得 | 第81页 |
| ·酸性蛋白酶基因SAP6基因组DNA全长序列的获得 | 第81页 |
| ·PCR结果观察 | 第81页 |
| ·PCR产物回收、连接、测序 | 第81页 |
| ·酸性蛋白酶基因SAP6生物信息学分析 | 第81-82页 |
| 3 结果与讨论 | 第82-95页 |
| ·海洋酵母M.reukaufii W6b RNA的提取和第一链cDNA的合成 | 第82-83页 |
| ·引物设计 | 第83页 |
| ·3'-RACE及5'-RACE PCR及全长cDNA的克隆 | 第83-86页 |
| ·酸性蛋白酶基因cDNA序列和推导的氨基酸序列 | 第86-87页 |
| ·酸性蛋白酶生物信息学分析 | 第87-95页 |
| ·酸性蛋白酶基因序列在NCBI的比对结果 | 第87-88页 |
| ·酸性蛋白酶氨基酸序列分析 | 第88-91页 |
| ·酸性蛋白酶SAP6氨基酸序列与其它酸性蛋白酶同源性比对 | 第91-95页 |
| 4 本章小结 | 第95-96页 |
| 第五章 酸性蛋白酶基因cDNASAP6在大肠杆菌中的表达、纯化和重组酶性质的研究 | 第96-119页 |
| 第一节 酸性蛋白酶基因cDNASAP6在大肠杆菌中的诱导表达 | 第96-110页 |
| 1 前言 | 第96页 |
| 2 材料和方法 | 第96-105页 |
| ·材料 | 第96-99页 |
| ·质粒和菌株 | 第96-97页 |
| ·试剂 | 第97页 |
| ·培养基 | 第97页 |
| ·缓冲液 | 第97-99页 |
| ·方法 | 第99-105页 |
| ·提取质粒pMD19T-cDNASAP6 | 第99页 |
| ·E.coli BL21(DE3)感受态的制备 | 第99页 |
| ·表达载体pET-24a(+)SAP6的构建 | 第99-101页 |
| ·pET-24a(+)SAP6在大肠杆菌中的诱导表达 | 第101-102页 |
| ·不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 | 第102-104页 |
| ·Immunoblotting(Western blotting)鉴定 | 第104-105页 |
| ·重组酸性蛋白酶酶活测定 | 第105页 |
| ·重组酸性蛋白酶的脱脂牛奶凝固试验 | 第105页 |
| 3 结果与讨论 | 第105-110页 |
| ·pET-24a(+)SAP6表达载体的构建 | 第105-106页 |
| ·pET-24a(+)SAP6在大肠杆菌中的诱导表达 | 第106-107页 |
| ·重组酸性蛋白酶酶活测定和水解能力分析 | 第107-110页 |
| 第二节 重组酸性蛋白酶的纯化和酶学性质研究 | 第110-118页 |
| 1.前言 | 第110页 |
| 2.材料和方法 | 第110-112页 |
| ·材料 | 第110页 |
| ·质粒和菌株 | 第110页 |
| ·试剂 | 第110页 |
| ·缓冲液 | 第110页 |
| ·方法 | 第110-112页 |
| ·pET-24a(+)SAP6在大肠杆菌中的诱导表达 | 第110-111页 |
| ·重组酸性蛋白酶粗酶液的制备 | 第111页 |
| ·重组酸性蛋白酶的纯化 | 第111页 |
| ·纯化的重组蛋白(rSAP6)SDS-PAGE和Western blotting鉴定 | 第111页 |
| ·酶活力测定 | 第111页 |
| ·蛋白酶含量测定 | 第111页 |
| ·纯化的重组酸性蛋白酶(rSAP6)的酶学性质 | 第111-112页 |
| 3 结果与讨论 | 第112-118页 |
| ·重组酸性蛋白酶rSAP6-his的分离与纯化 | 第112-113页 |
| ·重组酸性蛋白酶rSAP6-his的酶学性质 | 第113-118页 |
| ·温度对酶活性及酶热稳定性的影响 | 第113-114页 |
| ·pH对酶活性及酶稳定性的影响 | 第114-115页 |
| ·金属离子对酶活力的影响 | 第115-116页 |
| ·酶抑制剂对重组酶活力的影响 | 第116-118页 |
| 4 本章小结 | 第118-119页 |
| 总结与创新点 | 第119-121页 |
| 参考文献 | 第121-134页 |
| 附录 | 第134-136页 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137页 |
