| 提要 | 第1-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-51页 |
| 第一节 谷胱甘肽过氧化物酶 | 第13-25页 |
| 1. GPx 的分类 | 第14-16页 |
| ·细胞内GPx (cGPx) | 第15页 |
| ·胃肠道GPx (giGPx) | 第15页 |
| ·血浆GPx (pGPx) | 第15页 |
| ·磷脂氢GPx (PHGPx) | 第15-16页 |
| 2. GPx 的结构 | 第16-18页 |
| ·牛cGPx 的结构 | 第16-18页 |
| ·人pGPx 的活性中心结构 | 第18页 |
| 3. GPx 的催化机制 | 第18-20页 |
| ·乒乓机制 | 第18-19页 |
| ·顺序机制 | 第19-20页 |
| 4. GPx 的人工模拟 | 第20-25页 |
| ·小分子GPx 模拟物 | 第21-23页 |
| ·生物大分子GPx 模拟物 | 第23-25页 |
| 第二节 谷胱甘肽硫转移酶 | 第25-30页 |
| 1. GST 的分类 | 第26-27页 |
| 2. GST 的结构 | 第27-29页 |
| 3. GST 的进化 | 第29-30页 |
| 第三节 硒蛋白的表达 | 第30-41页 |
| 1. Escherichia coli 的SeCys 插入机制表达硒蛋白 | 第30-35页 |
| ·硒代半胱氨酸的生物合成及掺入 | 第30-35页 |
| ·SeCys 插入机制制备硒蛋白的现状 | 第35页 |
| 2. Escherichia coli 半胱氨酸营养缺陷型表达硒蛋白 | 第35-41页 |
| ·营养缺陷型表达体系的来源 | 第35-37页 |
| ·营养缺陷型表达体系的发展 | 第37-39页 |
| ·利用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达硒蛋白 | 第39-41页 |
| 参考文献 | 第41-51页 |
| 第二章 本文立论依据 | 第51-57页 |
| 1. 构建碲代谷胱甘肽硫转移酶模拟 GPx | 第52-53页 |
| 2. 构建硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟 GPx | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-57页 |
| 第三章 构建碲代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx | 第57-99页 |
| 第一节 序言 | 第57-59页 |
| 第二节 碲代谷胱甘肽硫转移酶的表达载体 | 第59-61页 |
| 一、实验材料 | 第59-60页 |
| ·主要试剂 | 第59页 |
| ·菌株和质粒 | 第59页 |
| ·实验仪器 | 第59页 |
| ·培养基和主要溶液的配制 | 第59-60页 |
| 二、实验方法 | 第60-61页 |
| ·质粒的提取 | 第60页 |
| ·琼脂糖(Agarose)凝胶电泳 | 第60页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(以下均需无菌操作) | 第60-61页 |
| ·质粒的转化 | 第61页 |
| 三、结果分析 | 第61页 |
| 第三节 半胱氨酸营养缺陷型体系表达碲代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx 的可行性分析 | 第61-67页 |
| 一、实验材料 | 第61-62页 |
| ·主要试剂 | 第61-62页 |
| ·实验仪器 | 第62页 |
| 二、实验方法 | 第62-63页 |
| ·碲代半胱氨酸氧化还原电势的测定 | 第62页 |
| ·GSH 对碲代胱氨酸还原能力的判定 | 第62页 |
| ·碲代半胱氨酸同E. coli tRNACys 的氨酰化反应 | 第62-63页 |
| 三、结果分析 | 第63-66页 |
| ·碲代半胱氨酸的氧化还原电势 | 第63-64页 |
| ·GSH 对碲代胱氨酸的还原能力 | 第64-65页 |
| ·碲代半胱氨酸同E. coli tRNACys 的氨酰化反应 | 第65-66页 |
| 四、讨论 | 第66-67页 |
| 第四节 碲代谷胱甘肽硫转移酶、野生型谷胱甘肽硫转移酶及其突变体的表达、分离提纯及表征 | 第67-79页 |
| 一、实验材料 | 第67-68页 |
| ·主要试剂 | 第67页 |
| ·实验仪器 | 第67页 |
| ·主要溶液的配制 | 第67-68页 |
| 二、实验方法 | 第68-72页 |
| ·野生型LuGST1-1 及其突变体的表达 | 第69页 |
| ·Telluro-LuGST1-1 的表达 | 第69-70页 |
| ·Seleno-LuGST1-1 的诱导表达 | 第70页 |
| ·LuGST1-1 及其突变体、telluro-LuGST1、seleno-LuGST1-1的纯化 | 第70页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第70-71页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第71页 |
| ·质谱鉴定 | 第71页 |
| ·碲含量的测定 | 第71-72页 |
| 三、结果分析 | 第72-76页 |
| ·野生型LuGST1-1 及其突变体的表达 | 第72页 |
| ·Telluro-LuGST1-1 的表达 | 第72-73页 |
| ·Telluro-LuGST1-1 的分离提纯 | 第73-75页 |
| ·Telluro-LuGST1-1 的质谱鉴定 | 第75-76页 |
| ·Telluro-LuGST1-1 碲含量的测定 | 第76页 |
| 四、讨论 | 第76-79页 |
| 第五节 碲代谷胱甘肽硫转移酶的酶学性质分析 | 第79-89页 |
| 一、实验材料 | 第79页 |
| ·主要试剂 | 第79页 |
| ·实验仪器 | 第79页 |
| 二、实验方法 | 第79-81页 |
| ·活力的测定 | 第79-80页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第80页 |
| ·温度和pH 值对模拟酶GPx 活性影响的测定 | 第80页 |
| ·Telluro-LuGST1-1 的稳定性 | 第80-81页 |
| 三、 结果分析 | 第81-84页 |
| ·Telluro-LuGST1-1 的GPx 与GST 活力 | 第81-83页 |
| ·最适pH 值和最适温度 | 第83页 |
| ·Telluro-LuGST1-1 的稳定性 | 第83-84页 |
| 四、讨论 | 第84-89页 |
| 第六节 碲代谷胱甘肽硫转移酶的动力学研究 | 第89-94页 |
| 一、实验材料 | 第89-90页 |
| ·主要试剂 | 第89页 |
| ·实验仪器 | 第89-90页 |
| 二、实验方法 | 第90页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第90页 |
| ·稳态动力学性质研究 | 第90页 |
| 三、结果分析 | 第90-92页 |
| 四、讨论 | 第92-94页 |
| 本章小结 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-99页 |
| 第四章 构建硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx | 第99-119页 |
| 第一节 序言 | 第99-100页 |
| 第二节 酶和底物相互作用的计算机模拟 | 第100-101页 |
| 一、实验方法 | 第100页 |
| 二、结果与讨论 | 第100-101页 |
| 第三节 硒代谷胱甘肽硫转移酶表达载体的构建 | 第101-104页 |
| 一、实验材料 | 第101页 |
| ·主要试剂 | 第101页 |
| ·菌株和质粒 | 第101页 |
| ·主要仪器 | 第101页 |
| 二、实验方法 | 第101-103页 |
| ·目的基因Y113C 的定点突变 | 第101-102页 |
| ·目的基因C9S 的定点突变 | 第102-103页 |
| 三、结果与讨论 | 第103-104页 |
| ·关于Y113C 和C9S 的设计 | 第103页 |
| ·快速一步定点突变方法及原理 | 第103-104页 |
| 第四节 硒代谷胱甘肽硫转移酶的表达纯化 | 第104-111页 |
| 一、实验材料 | 第104页 |
| ·主要试剂 | 第104页 |
| ·实验仪器 | 第104页 |
| ·主要溶液的配制 | 第104页 |
| 二、实验方法 | 第104-106页 |
| ·野生型LuGST1-1 及其突变体的表达 | 第105页 |
| ·Seleno-LuGST1-1 的诱导表达 | 第105页 |
| ·LuGST1-1 及其突变体、seleno-LuGST1-1 的分离纯化.. | 第105页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第105页 |
| ·圆二色谱分析 | 第105-106页 |
| 三、结果分析 | 第106-110页 |
| ·野生型LuGST1-1 及其突变体的表达 | 第106页 |
| ·Seleno-LuGST1-1 的诱导表达 | 第106-108页 |
| ·Seleno-LuGST1-1 的分离纯化 | 第108-109页 |
| ·蛋白质的圆二色谱分析 | 第109-110页 |
| 四、讨论 | 第110-111页 |
| 第五节 硒代谷胱甘肽硫转移酶的酶学性质 | 第111-116页 |
| 一、实验材料 | 第111-112页 |
| ·主要试剂 | 第111-112页 |
| ·实验仪器 | 第112页 |
| 二、实验方法 | 第112-113页 |
| ·以CNBSH 为底物的GPx 活力的测定 | 第112页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第112页 |
| ·温度和pH 值对模拟酶GPx 活性影响的测定 | 第112页 |
| ·稳态动力学性质研究 | 第112-113页 |
| 三、 结果分析 | 第113-115页 |
| ·Seleno-LuGST1-1 以CDNSH 为底物的GPx 活力 | 第113页 |
| ·最适pH 值和最适温度 | 第113-114页 |
| ·稳态动力学性质 | 第114-115页 |
| 四、讨论 | 第115-116页 |
| 本章小结 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-119页 |
| 结论 | 第119-120页 |
| 作者简历 | 第120页 |
| 博士期间发表的论文 | 第120-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 中文摘要 | 第122-125页 |
| ABSTRACT | 第125-128页 |
