| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-9页 |
| 缩略词表 | 第9-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-23页 |
| 1. HCMV 感染 | 第11-12页 |
| 2. 先天性HCMV 感染严重威胁婴幼儿的健康 | 第12页 |
| 3. HCMV 的防治 | 第12-16页 |
| ·抗HCMV 治疗 | 第12-13页 |
| ·抗HCMV 治疗的新药物 | 第13-14页 |
| ·先天性HCMV 感染的治疗 | 第14-16页 |
| 4. HCMV 临床低传代病毒株基因组结构 | 第16-18页 |
| 5. UL148 基因的相关研究 | 第18页 |
| 6. 核酶P 简介 | 第18-20页 |
| ·核酶P 的简介及分类 | 第18-19页 |
| ·M1RNA 的高级结构特征 | 第19-20页 |
| 7. 外部引导序列EGS 技术介绍 | 第20-22页 |
| 8. EGS 技术对于研究HCMV 致病机制、基因功能及治疗HCMV 感染的研究意义 | 第22-23页 |
| 第二章 主要仪器与材料 | 第23-27页 |
| 1. 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2. 材料 | 第24-27页 |
| ·主要试剂 | 第24-25页 |
| ·质粒、菌种和病毒株 | 第25页 |
| ·其它主要试剂配方 | 第25-27页 |
| 第三章 研究报告 | 第27-62页 |
| 第一部分 细胞外切割研究 | 第27-44页 |
| 一、技术路线 | 第27-28页 |
| 二、方法 | 第28-36页 |
| 1. EGS 设计与合成 | 第28页 |
| ·EGS 结构 | 第28页 |
| ·EGS 的合成 | 第28页 |
| 2. UL148 的分子克隆 | 第28-30页 |
| ·克隆型载体图谱 | 第28页 |
| ·UL148 基因的PCR 扩增 | 第28-29页 |
| ·PCR 产物回收纯化 | 第29页 |
| ·PCR 产物和载体质粒的酶切 | 第29-30页 |
| ·连接反应 | 第30页 |
| ·制备和转化感受态大肠杆菌 | 第30页 |
| ·重组质粒的抽提 | 第30页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第30页 |
| 3. UL148 基因小片段转录模板制备 | 第30-32页 |
| 4. M1RNA 的转录模板制备 | 第32-34页 |
| ·克隆载体多克隆位点图（pUC18） | 第32页 |
| ·大肠杆菌来源M1RNA 基因的PCR 扩增 | 第32-33页 |
| ·从琼脂糖凝胶中回收纯化PCR 产物 | 第33页 |
| ·载体与PCR 产物的双酶切 | 第33页 |
| ·连接反应 | 第33页 |
| ·转化 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的快速鉴定及抽提 | 第34页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第34页 |
| ·M1RNA 线性模板制备 | 第34页 |
| 5. UL148 小片段体外转录 | 第34-35页 |
| 6. M1RNA 体外转录 | 第35页 |
| 7. 细胞外切割实验 | 第35页 |
| 8. 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与Typhoon 扫描 | 第35-36页 |
| 三、结果 | 第36-41页 |
| 1. EGS 设计结果 | 第36页 |
| 2. pT148 质粒鉴定 | 第36-37页 |
| 3. UL148 小片段体外转录模板制备结果 | 第37页 |
| 4. M1RNA 重组质粒鉴定与体外转录模板制备结果 | 第37-38页 |
| 5. UL148 小片段体外转录结果 | 第38-39页 |
| 6. M1RNA 体外转录 | 第39页 |
| 7. 细胞外切割结果 | 第39-41页 |
| 四、讨论 | 第41-44页 |
| 1. 关于EGS 设计 | 第41-42页 |
| 2. 关于底物片段的处理 | 第42-43页 |
| 3. 底物、核酶与EGS 的比例 | 第43-44页 |
| 第二部分 细胞内切割研究 | 第44-60页 |
| 一、技术路线 | 第44-45页 |
| 二、方法 | 第45-50页 |
| 1. EGS 设计 | 第45页 |
| 2. p148-EGFP 重组质粒的构建 | 第45-47页 |
| ·克隆载体多克隆位点图 | 第45页 |
| ·UL148 基因PCR 扩增 | 第45-46页 |
| ·引物设计 | 第45-46页 |
| ·PCR 反应体系 | 第46页 |
| ·PCR 产物回收纯化 | 第46页 |
| ·载体与PCR 产物的双酶切实验 | 第46-47页 |
| ·连接反应 | 第47页 |
| ·连接产物的转化 | 第47页 |
| ·p148-EGFP 重组质粒的快速鉴定及抽提 | 第47页 |
| ·p148-EGFP 重组质粒的鉴定 | 第47页 |
| 3. UL148 稳定表达细胞株的建立 | 第47-48页 |
| ·HeLa 细胞的培养 | 第47页 |
| ·Lipofectamine 2000 的转染方案 | 第47-48页 |
| ·G418 筛选 | 第48页 |
| 4.E GFP 稳定表达细胞株的建立 | 第48页 |
| 5.R T-PCR 鉴定UL148 片段在胞内的表达 | 第48-49页 |
| ·RNA 的抽提 | 第48页 |
| ·RT-PCR 检测UL148 基因的表达 | 第48-49页 |
| ·cDNA 的合成 | 第48-49页 |
| ·UL148 的PCR 扩增 | 第49页 |
| 6. EGS 的细胞转染 | 第49页 |
| 7. 荧光显微镜观察EGS 对UL148 基因表达抑制 | 第49页 |
| 8. 荧光定量PCR 检测EGS 在胞内抑制UL148 基因的表达 | 第49-50页 |
| 三、结果 | 第50-55页 |
| 1. UL148 真核表达载体构建 | 第50-51页 |
| 2. UL148 稳定表达细胞株的建立 | 第51-52页 |
| ·UL148 融合蛋白在HeLa 细胞中的表达 | 第51页 |
| ·稳定表达UL148 的HeLa 细胞系建立 | 第51-52页 |
| ·稳定表达EGFP 的HeLa 细胞系的建立 | 第52页 |
| 3. RT-PCR 鉴定UL148 的表达 | 第52-53页 |
| 4. 荧光显微镜观察EGS 对UL148 基因的表达抑制 | 第53-55页 |
| 5. 荧光定量PCR 检测EGS 对UL148 基因的表达抑制 | 第55页 |
| 四、讨论 | 第55-60页 |
| 1. UL148 基因表达报告基团载体的选择 | 第55-56页 |
| 2. 目的基因在HeLa 细胞内的稳定表达 | 第56页 |
| 3. 关于EGS 基因沉默技术的选择 | 第56-57页 |
| 4. EGS 在细胞内抑制UL148 基因表达的效率 | 第57-58页 |
| 5. 不同浓度EGS 对HCMV UL148 基因沉默的效果 | 第58页 |
| 6. EGS 技术在临床的应用前景 | 第58-60页 |
| 第四部分 全文工作总结 | 第60-61页 |
| 第五部分 展望 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-70页 |
| 一、综述 | 第70-81页 |
| 参考文献 | 第79-81页 |
| 二、附录 | 第81-87页 |
| 1. 附图 | 第81-82页 |
| 2. 测序结果 | 第82-86页 |
| 3. 研究生期间发表的论文 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
