| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 绪论 | 第8-12页 |
| 1.1 副猪嗜血杆菌病的概况 | 第8-11页 |
| 1.1.1 副猪嗜血杆菌的生物学特性及血清型 | 第8-9页 |
| 1.1.2 副猪嗜血杆菌的流行病学特点 | 第9页 |
| 1.1.3 副猪嗜血杆菌病的发病机制 | 第9-10页 |
| 1.1.4 临床症状与病理变化 | 第10页 |
| 1.1.5 诊断与防治 | 第10-11页 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌毒力因子的研究进展 | 第11页 |
| 1.3 本研究的目的和意义 | 第11-12页 |
| 2 材料与方法 | 第12-24页 |
| 2.1 试验材料 | 第12-14页 |
| 2.1.1 菌株、质粒、感受态细胞 | 第12页 |
| 2.1.2 培养基及培养条件 | 第12页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第12-14页 |
| 2.1.4 主要试验仪器及设备 | 第14页 |
| 2.2 HbpA蛋白的筛选鉴定和生物学功能预测 | 第14-15页 |
| 2.2.1 HbpA蛋白的筛选和鉴定 | 第14页 |
| 2.2.2 HbpA蛋白生物学功能预测 | 第14-15页 |
| 2.3 HbpA蛋白的诱导表达 | 第15-16页 |
| 2.3.1 引物的设计及合成 | 第15页 |
| 2.3.2 重组表达质粒pET28a-HbpA的构建及测序 | 第15页 |
| 2.3.3 重组HbpA蛋白的诱导表达 | 第15-16页 |
| 2.4 用验证重组HbpA蛋白是否具有免疫原性 | 第16页 |
| 2.5 大量纯化HbpA蛋白 | 第16-17页 |
| 2.5.1 HbpA蛋白表达条件的优化及最佳漂洗和洗脱浓度的选择 | 第16-17页 |
| 2.5.2 以优化好的试验条件使用Ni柱大量纯化HbpA蛋白 | 第17页 |
| 2.6 血红素(Heme)结合卸载凝胶试验 | 第17页 |
| 2.7 利用IEM技术对HbpA蛋白和猪血红素结合位点进行亚细胞定位 | 第17-18页 |
| 2.8 利用免疫组化技术验证HPS在猪体内是否表达HbpA蛋白 | 第18-19页 |
| 2.9 HPS在补充多种Fe离子的情况下迅速恢复生长 | 第19页 |
| 2.10 HbpA抗体体外杀菌试验 | 第19-20页 |
| 2.11 RT-PCR验证不同培养条件下HbpA基因表达量的差异 | 第20-24页 |
| 2.11.1 qPCR标准品的制备 | 第20页 |
| 2.11.2 血清5型HPS总RNA的提取 | 第20-21页 |
| 2.11.3 RNA浓度、纯度和完整性检测 | 第21页 |
| 2.11.4 反转录 | 第21-22页 |
| 2.11.5 TaqMan qPCR | 第22-24页 |
| 3 结果 | 第24-36页 |
| 3.1 HbpA蛋白的筛选鉴定和生物学功能预测 | 第24-25页 |
| 3.1.1 HbpA蛋白的筛选鉴定 | 第24页 |
| 3.1.2 HbpA蛋白生物学功能预测 | 第24-25页 |
| 3.2 HbpA蛋白的诱导表达 | 第25-26页 |
| 3.2.1 重组表达质粒pET28a-HbpA的构建及测序 | 第25页 |
| 3.2.2 重组HbpA蛋白的诱导表达及免疫原性分析 | 第25-26页 |
| 3.3 大量纯化HbpA蛋白 | 第26-28页 |
| 3.3.1 HbpA蛋白表达条件的优化及最佳漂洗和洗脱浓度的选择 | 第26-27页 |
| 3.3.2 以优化好的试验条件大量纯化HbpA蛋白 | 第27-28页 |
| 3.4 血红素(Heme)结合卸载凝胶试验 | 第28页 |
| 3.5 利用IEM技术对HbpA蛋白和猪血红素结合位点进行亚细胞定位 | 第28-29页 |
| 3.6 利用免疫组化技术验证HPS在猪体内是否表达HbpA蛋白 | 第29页 |
| 3.7 HPS在补充多种Fe离子的情况下能迅速恢复生长 | 第29-31页 |
| 3.8 HbpA抗体体外杀菌试验 | 第31-32页 |
| 3.9 RT-PCR验证不同培养条件下HbpA基因表达量的差异 | 第32-36页 |
| 3.9.1 qPCR标准品的制备及质粒pMD~(TM)18T-HbpA浓度和拷贝数的计算 | 第32页 |
| 3.9.2 RNA浓度、纯度和完整性检测 | 第32-33页 |
| 3.9.3 TapMan qPCR | 第33-36页 |
| 4 讨论 | 第36-39页 |
| 4.1 HbpA蛋白研究的必要性 | 第36页 |
| 4.2 HPS的致病机理 | 第36-37页 |
| 4.3 对HbpA蛋白和猪血红素结合位点进行亚细胞定位方法的选择 | 第37-38页 |
| 4.4 Native-PAGE方法验证HbpA蛋白能否与Heme结合及其原因 | 第38-39页 |
| 结论 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-47页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第47-48页 |
| 致谢 | 第48-50页 |
