| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 1 综述 | 第12-34页 |
| ·重组豹蛙抗瘤酶（rrONC） | 第12-18页 |
| ·rrONC 的结构与理化性质 | 第12-14页 |
| ·rrONC 的药理作用 | 第14-16页 |
| ·rrONC 的临床应用 | 第16-17页 |
| ·rrONC 的产业化研究 | 第17-18页 |
| ·酵母表达系统 | 第18-31页 |
| ·毕赤酵母表达系统简介 | 第18-20页 |
| ·表达载体简介 | 第20-23页 |
| ·载体与基因组的整合 | 第23-26页 |
| ·外源蛋白的表达 | 第26-27页 |
| ·影响外源基因表达的因素及提高蛋白表达的途径 | 第27-31页 |
| ·重组豹蛙抗瘤酶（rrONC）的表达 | 第31-34页 |
| ·rrONC 的原核表达 | 第31-32页 |
| ·rrONC 的酵母表达 | 第32-34页 |
| 2 实验材料 | 第34-38页 |
| ·材料 | 第34-38页 |
| ·质粒及菌株 | 第34页 |
| ·试剂盒 | 第34页 |
| ·限制性内切酶 | 第34页 |
| ·蛋白及核酸分子量标准 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| ·主要试剂 | 第35页 |
| ·主要培养基和贮存液 | 第35-38页 |
| 3 实验方法 | 第38-52页 |
| ·重组表达质粒 pPIC9K- rrONC 的构建及鉴定 | 第38-41页 |
| ·质粒 pGH-rrONC 的制备 | 第38-39页 |
| ·质粒 pPIC9K 的制备 | 第39页 |
| ·感受态细胞（DH5α）的制备 | 第39-40页 |
| ·双酶切 | 第40-41页 |
| ·连接及转化 | 第41页 |
| ·含目的基因的毕赤酵母工程菌构建及诱导表达 | 第41-45页 |
| ·表达质粒 pPIC9K- rrONC 的线性化及纯化 | 第41-42页 |
| ·毕赤酵母 GS115 感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·氯化锂法转化 | 第42页 |
| ·基因组 PCR 法鉴定阳性重组子 | 第42-43页 |
| ·MM 和 MD 平板筛选 His+ Mut+阳性克隆 | 第43-44页 |
| ·重组菌的诱导表达及检测 | 第44-45页 |
| ·表达产物的质谱检测 | 第45页 |
| ·重组酵母菌在摇瓶中的最佳表达条件试验 | 第45-48页 |
| ·最佳体积、转速试验 | 第45-46页 |
| ·最佳 pH 条件试验 | 第46页 |
| ·最佳温度试验 | 第46-47页 |
| ·最佳甲醇浓度 | 第47页 |
| ·不同盐离子浓度试验 | 第47-48页 |
| ·目的蛋白纯化 | 第48-50页 |
| ·纯化原理 | 第48-49页 |
| ·纯化方案与步骤 | 第49-50页 |
| ·rrONC 的生物学活性检测 | 第50-52页 |
| ·细胞培养 | 第50页 |
| ·细胞计数 | 第50页 |
| ·MTT 检测 | 第50页 |
| ·Hochest 33258 染色 | 第50-51页 |
| ·统计学分析 | 第51-52页 |
| 4 实验结果 | 第52-64页 |
| ·重组表达质粒 pPIC9K- rrONC 的构建及鉴定 | 第52-54页 |
| ·pGH-rrONC 质粒的鉴定 | 第52页 |
| ·pPIC9K 质粒的鉴定 | 第52-53页 |
| ·双酶切结果 | 第53页 |
| ·阳性克隆鉴定 | 第53-54页 |
| ·含目的基因的毕赤酵母工程菌构建及诱导表达 | 第54-56页 |
| ·菌落 PCR 法初筛阳性重组子 | 第54页 |
| ·基因组 PCR 法鉴定阳性重组子 | 第54页 |
| ·MM 和 MD 平板筛选 His+Mut+阳性克隆 | 第54-55页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第55页 |
| ·表达产物的质谱检测 | 第55-56页 |
| ·重组酵母菌在摇瓶中的最佳表达条件试验 | 第56-59页 |
| ·最佳体积、转速试验 | 第56页 |
| ·最佳 pH 条件试验 | 第56-57页 |
| ·最佳温度试验 | 第57页 |
| ·最佳甲醇浓度试验 | 第57-58页 |
| ·不同盐离子浓度试验 | 第58-59页 |
| ·目的蛋白纯化 | 第59-60页 |
| ·纯化产物及鉴定 | 第59-60页 |
| ·纯化的产物纯度与收率 | 第60页 |
| ·表达产物的生物学活性检测 | 第60-64页 |
| ·MTT 法检测表达产物对十种细胞的生物学作用 | 第60-61页 |
| ·Hoechst 33258 染色观察结果 | 第61-64页 |
| 5 讨论 | 第64-70页 |
| 结论 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-78页 |
| 攻读硕士学位期间参加的科研项目和已发表及待发表论文 | 第78-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
