| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第11-18页 |
| 1.1 苯酚及其危害 | 第11页 |
| 1.2 苯酚的降解方式 | 第11-12页 |
| 1.3 微生物降解苯酚 | 第12-14页 |
| 1.3.1 降解苯酚的微生物 | 第12页 |
| 1.3.2 微生物降解苯酚的方式 | 第12-14页 |
| 1.4 苯酚羟化酶的研究 | 第14-15页 |
| 1.5 谷氨酸棒状杆菌降解芳香族化合物的概述 | 第15-17页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第17-18页 |
| 第二章 敲除质粒和原核表达质粒克隆的构建 | 第18-28页 |
| 2.1 材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 主要试剂及培养基 | 第18页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第18-19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-24页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第19-20页 |
| 2.2.2 谷氨酸棒状杆菌基因组 DNA 提取 | 第20页 |
| 2.2.3 PCR 扩增 | 第20-21页 |
| 2.2.4 胶回收目的片段 | 第21页 |
| 2.2.5 目的片段及载体的酶切、连接与转化 | 第21-23页 |
| 2.2.6 RbCl2法制备大肠杆菌感受态 | 第23页 |
| 2.2.7 菌落 PCR 鉴定及双酶切反应鉴定 | 第23页 |
| 2.2.8 重组质粒的鉴定 | 第23-24页 |
| 2.3. 结果与分析 | 第24-27页 |
| 2.3.1 敲除质粒构建原理 | 第24-25页 |
| 2.3.2 敲除质粒 pK18mobsacB-Δ2588 的构建 | 第25-26页 |
| 2.3.3 原核表达质粒 pET28a-ncgl2588 的构建 | 第26-27页 |
| 2.4 讨论 | 第27-28页 |
| 第三章 谷氨酸棒杆菌中苯酚羟化酶基因的敲除及生理生化研究 | 第28-35页 |
| 3.1 实验材料 | 第28页 |
| 3.1.1 菌种及质粒 | 第28页 |
| 3.1.2 主要试剂及培养基 | 第28页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第28页 |
| 3.2 实验方法 | 第28-30页 |
| 3.2.1 谷氨酸棒状杆菌 RES167 感受态制备 | 第28-29页 |
| 3.2.2 谷氨酸棒状杆菌中敲除质粒的转化 | 第29页 |
| 3.2.3 不同培养基中谷氨酸棒杆菌生长曲线的测定 | 第29页 |
| 3.2.4 不同碳源对苯酚羟化酶表达量的测定 | 第29-30页 |
| 3.3 结果与分析 | 第30-34页 |
| 3.3.1 进化树分析 | 第30-31页 |
| 3.3.2 基因敲除分析 | 第31-33页 |
| 3.3.3 野生型与缺失突变体对苯酚利用能力的分析 | 第33页 |
| 3.3.4 不同碳源对苯酚羟化酶表达情况的分析 | 第33-34页 |
| 3.4 讨论 | 第34-35页 |
| 第四章 Ncgl2588 基因的原核表达以及苯酚羟化酶酶学性质测定 | 第35-47页 |
| 4.1 材料 | 第35页 |
| 4.1.1 主要试剂 | 第35页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第35页 |
| 4.2 实验方法 | 第35-39页 |
| 4.2.0 目的蛋白的原核表达 | 第35-36页 |
| 4.2.1 蛋白纯化 | 第36页 |
| 4.2.2 SDS-PAGE 蛋白胶的配制与电泳分析 | 第36-37页 |
| 4.2.3 苯酚羟化酶的酶活测定 | 第37页 |
| 4.2.4 苯酚羟化酶酶学性质的测定 | 第37-38页 |
| 4.2.5 苯酚羟化酶蛋白的定点突变及酶学性质的比较 | 第38-39页 |
| 4.3 结果与分析 | 第39-45页 |
| 4.3.1 目的蛋白的原核表达与纯化 | 第39-40页 |
| 4.3.2 重组蛋白的苯酚羟化酶活性测定 | 第40-41页 |
| 4.3.3 苯酚羟化酶的米氏常数 Km 值 | 第41页 |
| 4.3.4 苯酚羟化酶的最适 pH | 第41-42页 |
| 4.3.5 苯酚羟化酶的最适温度 | 第42页 |
| 4.3.6 苯酚羟化酶的低温稳定性 | 第42-43页 |
| 4.3.7 苯酚羟化酶的底物范围 | 第43-44页 |
| 4.3.8 金属离子对苯酚羟化酶活性的影响 | 第44页 |
| 4.3.9 苯酚羟化酶蛋白的定点突变及酶学性质的比较 | 第44-45页 |
| 4.4 讨论 | 第45-47页 |
| 第五章 总结 | 第47-49页 |
| 参考文献 | 第49-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 作者简介及 在读期间发表文章 | 第57页 |
