| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 第一章 序言 | 第16-46页 |
| 1. MicroRNA简介 | 第16-28页 |
| 1.1 MicroRNA的定义和基本特征 | 第16-17页 |
| 1.2 microRNA的发现 | 第17-18页 |
| 1.3 microRNA的命名 | 第18-19页 |
| 1.4 microRNA的生物合成 | 第19-20页 |
| 1.5 microRNA的作用机制和生物学功能 | 第20-28页 |
| 1.5.1 microRNA调控基因的作用机制 | 第20-24页 |
| 1.5.2 miRNA的正向调控和可逆的抑制 | 第24-25页 |
| 1.5.3 P-body,Stress Granules(SG),Multivesicular Bodies和Endosomes在miRNA介导基因表达沉默中的功能 | 第25-26页 |
| 1.5.4 microRNA的生物学功能 | 第26-28页 |
| 2. 乙肝病毒(HBV)简介 | 第28-36页 |
| 2.1 肝病毒(HBV)的定义和基本特征 | 第28-31页 |
| 2.2 乙肝病毒(HBV)所编码蛋白的生物学功能 | 第31-34页 |
| 2.2.1 表面蛋白(S蛋白)的生物学功能 | 第31-32页 |
| 2.2.2 核心蛋白(C蛋白)和e抗原(HBeAg)的生物学功能 | 第32页 |
| 2.2.3 聚合酶P蛋白的生物学功能 | 第32-33页 |
| 2.2.4 X蛋白的生物学功能 | 第33-34页 |
| 2.3 HBV相关疾病以及相关治疗的近况和进展 | 第34-36页 |
| 3. microRNA与病毒之间的网络调控作用 | 第36-44页 |
| 3.1 microRNA对病毒的调控作用 | 第36页 |
| 3.2 病毒自身编码的microRNA对其自身复制以及宿主的调控作用 | 第36-40页 |
| 3.2.1 病毒自身编码的microRNA(vmiRNA) | 第36-38页 |
| 3.2.2 病毒编码的microRNA对病毒自身编码的基因表达,转录本RNA以及复制的调控作用 | 第38页 |
| 3.2.3 病毒自身编码的microRNA对宿主mRNA的调控作用 | 第38-40页 |
| 3.3 病毒对microRNA的调节作用 | 第40页 |
| 3.4 miRNA在相关肝疾病中作用 | 第40-42页 |
| 3.5 microRNA与HBV病毒的复制以及由其感染所引发的肝癌疾病中等相互调控作用的研究进展 | 第42-44页 |
| 3.5.1 miRNA调控乙肝病毒HBV的复制 | 第42-43页 |
| 3.5.2 miRNA与肝炎病毒导致的HCC | 第43-44页 |
| 4. miR15a/16的生物学功能 | 第44-45页 |
| 5. 本课题的研究内容及意义 | 第45-46页 |
| 5.1 本课题的研究内容 | 第45页 |
| 5.2 本课题的研究意义 | 第45-46页 |
| 第二章 材料与方法 | 第46-72页 |
| 1. 材料 | 第46-56页 |
| 1.1 实验所用到的菌株,质粒和细胞系 | 第46页 |
| 1.2 实验中所用到主要的生化试剂以及来源 | 第46页 |
| 1.3 分子克隆相关实验中所用到的酶和试剂盒及来源 | 第46-47页 |
| 1.4 分子克隆和生化实验等相关实验中所用到溶液及配置 | 第47-50页 |
| 1.4.1 制备感受态细胞以及检测所用的溶液及配置 | 第47-48页 |
| 1.4.2 SDS碱裂解法提取质粒所用的溶液及配置 | 第48页 |
| 1.4.3 核酸电泳以及蛋白质电泳所用到的溶液及配置 | 第48-50页 |
| 1.5 细胞实验中所用到的试剂来源以及所用的溶液的配置 | 第50-51页 |
| 1.5.1 试剂 | 第50-51页 |
| 1.5.2 细胞实验中所用到溶液的配置 | 第51页 |
| 1.6 本实验中所用到的引物 | 第51-54页 |
| 1.7 本实验所用到RNA oligo | 第54页 |
| 1.8 本实验中所构建的质粒 | 第54-55页 |
| 1.9 本实验用到的仪器 | 第55页 |
| 1.10 绘图软件 | 第55-56页 |
| 1.11 分析软件 | 第56页 |
| 2. 方法 | 第56-72页 |
| 2.1 普通克隆的构建方法 | 第56页 |
| 2.2 制备大肠杆菌(E.coli DH5α)感受态细胞以及检测转化效率 | 第56-57页 |
| 2.2.1 受体菌的活化培养 | 第56页 |
| 2.2.2 感受态细胞的制备 | 第56-57页 |
| 2.2.3 感受态细胞转化效率的检测 | 第57页 |
| 2.3 SDS碱裂解法质粒DNA的制备(分子克隆所用) | 第57-58页 |
| 2.4 超纯质粒的制备(细胞转染所用) | 第58页 |
| 2.5 从DMEM培养液中提取HBV病毒颗粒(以24孔板为例) | 第58-59页 |
| 2.6 乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原的检测(酶联免疫法) | 第59页 |
| 2.7 细胞实验操作 | 第59-63页 |
| 2.7.1 细胞的复苏 | 第59-60页 |
| 2.7.2 细胞传代培养 | 第60页 |
| 2.7.3 细胞转染 | 第60-62页 |
| 2.7.4 细胞冻存 | 第62-63页 |
| 2.8 RT-PCR | 第63-64页 |
| 2.8.1 RNA的提取(以24孔的培养板为例) | 第63页 |
| 2.8.2 基因组DNA的消解 | 第63页 |
| 2.8.3 RNA的逆转录 | 第63-64页 |
| 2.8.4 用制备好的cDNA为模板进行PCR | 第64页 |
| 2.9 荧光定量PCR | 第64-65页 |
| 2.9.1 标准样品的制备 | 第64页 |
| 2.9.2 样品及标准样品的扩增 | 第64-65页 |
| 2.10 Western blot | 第65-70页 |
| 2.10.1 蛋白样品的制备一 | 第65页 |
| 2.10.2 蛋白样品的制备二(从TRIzol中提取蛋白) | 第65-66页 |
| 2.10.3 蛋白含量的测定 | 第66-67页 |
| 2.10.4 SDS-PAGE电泳 | 第67-68页 |
| 2.10.5 转膜 | 第68-69页 |
| 2.10.6 免疫反应 | 第69页 |
| 2.10.7 化学发光,显影,定影 | 第69-70页 |
| 2.10.8 凝胶图像定量分析 | 第70页 |
| 2.11 双色荧光的检测 | 第70-72页 |
| 2.11.1 细胞样品的处理 | 第70-71页 |
| 2.11.2 荧光素酶活性的测定 | 第71-72页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第72-86页 |
| 1. 结果 | 第72-83页 |
| 1.1 microRNA与HBV病毒之间存在重要的相互作用 | 第72-74页 |
| 1.1.1 miRNApathway参与并影响HBV的复制 | 第72-73页 |
| 1.1.2 HBV侵染宿主细胞之后,miRNA表达水平的变化 | 第73-74页 |
| 1.2 miR15a/16抑制HBV增殖 | 第74-77页 |
| 1.2.1 预测miR15a在HBV基因组上潜在的靶标信息 | 第74-75页 |
| 1.2.2 miR-15a抑制HBV复制 | 第75-77页 |
| 1.3 miR-15a分别靶定在HBx和HBp的CDS区域 | 第77-80页 |
| 1.3.1 荧光素酶报告基因证实miR-15a对靶定在HBx和HBp的重叠区域的调控 | 第77-78页 |
| 1.3.2 荧光索酶报告检测证实miR-15a对靶定在HBp区域的靶标位点的调控 | 第78-79页 |
| 1.3.3 miR-15a对HBx蛋白的调节 | 第79-80页 |
| 1.4 HBx可以调节miRNA的表达 | 第80-83页 |
| 2. 讨论 | 第83-86页 |
| 第四章 研究工作总结与展望 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
