| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 符号说明 | 第11-13页 |
| 1 前言 | 第13-15页 |
| 2 PAEP表达抑制细胞系的建立 | 第15-31页 |
| 2.1 材料 | 第15-18页 |
| 2.1.1 主要仪器 | 第15-16页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第16-17页 |
| 2.1.3 主要液体及配制 | 第17页 |
| 2.1.4 细胞系 | 第17页 |
| 2.1.5 siRNA和慢病毒为载体的shRNA构建 | 第17-18页 |
| 2.2 方法 | 第18-26页 |
| 2.2.1 黑色素瘤细胞系的培养 | 第18页 |
| 2.2.2 RNA提取和PAEP基因RT-PCR扩增 | 第18-20页 |
| 2.2.3 PAEP siRNA瞬时转染 | 第20-21页 |
| 2.2.4 RT-PCR检测siRNA瞬时转染后PAEP的表达 | 第21-23页 |
| 2.2.5 慢病毒介导的PAEP shRNA稳定转染黑素瘤细胞 | 第23页 |
| 2.2.6 RT-PCR检测稳定转染后PAEP的表达 | 第23页 |
| 2.2.7 Western blot检测稳定转染后PAEP蛋白水平的表达变化 | 第23-26页 |
| 2.3 结果 | 第26-29页 |
| 2.3.1 624.38-Mel和MCC69B细胞表达PAEP | 第26页 |
| 2.3.2 PAEP siRNA能有效地降低624.38-Mel细胞PAEP的表达 | 第26-27页 |
| 2.3.3 慢病毒对624.38-Mel细胞有较高的转染效率 | 第27-28页 |
| 2.3.4 PAEP表达抑制稳定细胞株的建立 | 第28-29页 |
| 2.4 讨论 | 第29-31页 |
| 3 外周血淋巴细胞的体外培养 | 第31-38页 |
| 3.1 材料 | 第31-32页 |
| 3.1.1 主要仪器 | 第31页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第31-32页 |
| 3.1.3 主要液体及配制 | 第32页 |
| 3.1.4 外周血 | 第32页 |
| 3.2 方法 | 第32-34页 |
| 3.2.1 密度梯度离心法分离PBMC | 第32页 |
| 3.2.2 PBMC的体外刺激培养 | 第32-33页 |
| 3.2.3 FACS检测PBMC存活率 | 第33页 |
| 3.2.4 免疫磁珠分选CD8+T细胞 | 第33-34页 |
| 3.3 结果 | 第34-37页 |
| 3.3.1 PBMC体外培养条件优化 | 第34-36页 |
| 3.3.2 免疫磁珠分选CD8+T细胞的得率和纯化效率 | 第36-37页 |
| 3.4 讨论 | 第37-38页 |
| 4 黑素瘤分泌的PAEP对T细胞功能的影响 | 第38-51页 |
| 4.1 材料 | 第38-40页 |
| 4.1.1 主要仪器 | 第38-39页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第39页 |
| 4.1.3 主要液体及配制 | 第39-40页 |
| 4.1.4 外周血 | 第40页 |
| 4.1.5 细胞系 | 第40页 |
| 4.2 方法 | 第40-44页 |
| 4.2.1 ELISA法检测PAEP的分泌表达 | 第40页 |
| 4.2.2 MTS法检测PAEP对PBMC增殖的影响 | 第40-41页 |
| 4.2.3 Annexin Ⅴ检测PAEP对PBMC和CD8+T的诱导凋亡作用 | 第41页 |
| 4.2.4 624.38-Mel细胞HLA基因测序 | 第41页 |
| 4.2.5 PBMC细胞RNA提取和HLA-A2基因PCR扩增 | 第41-43页 |
| 4.2.6 混合淋巴细胞和肿瘤细胞反应(MLTR) | 第43页 |
| 4.2.7 细胞毒分析 | 第43-44页 |
| 4.2.8 统计学分析 | 第44页 |
| 4.3 结果 | 第44-49页 |
| 4.3.1 PAEP在624.38-Mel中的表达量 | 第44页 |
| 4.3.2 PAEP对PBMC的增殖抑制作用 | 第44-45页 |
| 4.3.3 PAEP对淋巴细胞凋亡的影响 | 第45-47页 |
| 4.3.4 基因测序检测624.38-Mel细胞HLA分型 | 第47页 |
| 4.3.5 RT-PCR筛选HLA-A2+的人PBMC | 第47-48页 |
| 4.3.6 MLTR | 第48-49页 |
| 4.3.7 细胞毒分析 | 第49页 |
| 4.4 讨论 | 第49-51页 |
| 5 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-56页 |
| 附录 | 第56-57页 |
| 综述 | 第57-64页 |
| 参考文献 | 第61-64页 |
| 攻读学位期间主要的研究成果目录 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
