| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 1．文献综述 | 第12-21页 |
| 1.1 弓形虫综述 | 第12-14页 |
| 1.1.1 弓形虫与弓形虫病 | 第12页 |
| 1.1.2 弓形虫生活史 | 第12-13页 |
| 1.1.3 弓形虫病治疗与疫苗 | 第13-14页 |
| 1.2 弓形虫缓殖子分化发育研究进展 | 第14-18页 |
| 1.2.1 弓形虫缓殖子形成 | 第14-15页 |
| 1.2.2 宿主细胞对弓形虫缓殖子发育的影响 | 第15页 |
| 1.2.3 弓形虫自身调控机制对缓殖子分化发育的影响 | 第15-18页 |
| 1.3 三十四肽重复结构域研究进展 | 第18-19页 |
| 1.4 CRISPR/CAS9系统研究进展 | 第19-21页 |
| 2．研究目的与意义 | 第21-22页 |
| 3．材料与方法 | 第22-36页 |
| 3.1 实验材料 | 第22-23页 |
| 3.1.1 实验动物 | 第22页 |
| 3.1.2 实验菌株、虫株与细胞 | 第22页 |
| 3.1.3 载体与质粒 | 第22页 |
| 3.1.4 引物 | 第22-23页 |
| 3.2 主要仪器与试剂 | 第23-25页 |
| 3.2.1 主要仪器 | 第23页 |
| 3.2.2 主要试剂盒 | 第23页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第23-24页 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 | 第24-25页 |
| 3.3 实验方法 | 第25-36页 |
| 3.3.1 弓形虫的体外培养 | 第25页 |
| 3.3.2 弓形虫基因组DNA的提取 | 第25-26页 |
| 3.3.3 弓形虫RNA的提取 | 第26页 |
| 3.3.4 弓形虫cDNA的制备 | 第26-27页 |
| 3.3.5 基因敲除相关质粒的构建 | 第27-29页 |
| 3.3.6 重组蛋白的原核表达 | 第29页 |
| 3.3.7 His融合蛋白的镍柱纯化 | 第29-30页 |
| 3.3.8 纯化蛋白的透析与保存 | 第30页 |
| 3.3.9 BCA法蛋白质浓度测定 | 第30-31页 |
| 3.3.10 ANK1敲除株的构建及鉴定 | 第31-33页 |
| 3.3.11 空斑实验 | 第33页 |
| 3.3.12 复制实验 | 第33页 |
| 3.3.13 弓形虫虫株毒力实验 | 第33-34页 |
| 3.3.14 弓形虫脑包囊计数 | 第34页 |
| 3.3.15 敲除株对小鼠保护力实验 | 第34页 |
| 3.3.16 体外诱导弓形虫缓殖子形成 | 第34-35页 |
| 3.3.17 RNA-seq检测敲除株与野生株基因表达差异 | 第35-36页 |
| 4．结果与分析 | 第36-55页 |
| 4.1 弓形虫ANK1蛋白N-端及全长原核表达、蛋白纯化 | 第36-41页 |
| 4.1.1 ANK1基因N-端及全长片段扩增 | 第36页 |
| 4.1.2 ANK1基因N-端及全长表达质粒构建 | 第36-37页 |
| 4.1.3 ANK1蛋白N-端及全长原核表达 | 第37-39页 |
| 4.1.4 ANK1蛋白全长表达条件的优化 | 第39页 |
| 4.1.5 ANK1蛋白N-端及全长蛋白纯化 | 第39-41页 |
| 4.2 ANK1敲除质粒的构建 | 第41-45页 |
| 4.2.1.pANK1-DHFR质粒的构建 | 第41-43页 |
| 4.2.2 ANK1敲除株的构建 | 第43-44页 |
| 4.2.3 ANK1敲除株鉴定 | 第44-45页 |
| 4.3 ANK1敲除株表型研究 | 第45-50页 |
| 4.3.1 空斑实验 | 第45页 |
| 4.3.2 复制实验 | 第45-46页 |
| 4.3.3 毒力实验 | 第46-47页 |
| 4.3.4 小鼠脑包囊形成实验 | 第47-48页 |
| 4.3.5 不同剂量敲除株对小鼠毒力 | 第48-49页 |
| 4.3.6 小鼠保护力实验 | 第49-50页 |
| 4.4 RNA-seq检测ANK1敲除株与野生株基因表达差异 | 第50-55页 |
| 4.4.1 野生株和敲除株速殖子与缓殖子RNA样本的制备 | 第50-51页 |
| 4.4.2 RNA-seq检测敲除株与野生株基因表达量差异 | 第51-55页 |
| 5．讨论 | 第55-59页 |
| 5.1 弓形虫ANK1蛋白N-端及全长的原核表达 | 第55页 |
| 5.2 弓形虫ANK1基因敲除株的构建及表型研究 | 第55-57页 |
| 5.3 RNA-seq检测敲除株与野生株基因差异性表达 | 第57-59页 |
| 6．结论 | 第59页 |
| 7．展望 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
