| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 1 前言 | 第16-39页 |
| 1.1 植物与铁 | 第16-19页 |
| 1.1.1 铁的生理功能 | 第16页 |
| 1.1.2 植物铁吸收机制 | 第16-17页 |
| 1.1.3 植物铁吸收影响因素 | 第17-18页 |
| 1.1.4 铁吸收和转运相关的基因 | 第18-19页 |
| 1.1.4.1 机理Ⅰ系统中的主要相关基因 | 第18-19页 |
| 1.1.4.2 机理Ⅱ系统中的主要相关基因 | 第19页 |
| 1.1.4.3 其他 | 第19页 |
| 1.2 植物铁吸收信号转导途径 | 第19-29页 |
| 1.2.1 植物感应缺铁产生的信号物质 | 第19-20页 |
| 1.2.2 铁响应相关的基因 | 第20-27页 |
| 1.2.2.1 机理Ⅰ植物 | 第20-25页 |
| 1.2.2.1.1 bHLH蛋白的结构 | 第21页 |
| 1.2.2.1.2 bHLH蛋白的功能 | 第21页 |
| 1.2.2.1.3 bHLH转录因子与铁吸收 | 第21-25页 |
| 1.2.2.3 机理Ⅱ植物 | 第25-27页 |
| 1.2.3 铁离子感受器(sensor) | 第27-29页 |
| 1.3 质膜型(Plasma membrane,PM)H~+-ATPase酶 | 第29-34页 |
| 1.3.1 质膜H~+-ATPase的结构 | 第29-30页 |
| 1.3.3 质膜H~+-ATPase生理功能 | 第30页 |
| 1.3.4 营养元素与质膜H~+-ATPase的活性关系 | 第30-32页 |
| 1.3.5 质膜H~+-ATPase的转录水平的调控 | 第32-33页 |
| 1.3.6 质膜H~+-ATPase的翻译后水平上的调控 | 第33-34页 |
| 1.3.6.1 H~+-ATPase中C末端的调节作用 | 第33页 |
| 1.3.6.2 磷酸化修饰 | 第33-34页 |
| 1.4 BTB/POZ蛋白 | 第34-37页 |
| 1.4.1 BTB/POZ蛋白研究进展 | 第34-35页 |
| 1.4.2 BTB-TAZ蛋白 | 第35-36页 |
| 1.4.3 BTB-TAZ蛋白功能 | 第36-37页 |
| 1.4.4 BTB-TAZ蛋白与信号 | 第37页 |
| 1.5 研究的目的和意义 | 第37-39页 |
| 2 材料与方法 | 第39-67页 |
| 2.1 材料 | 第39-41页 |
| 2.1.0 植物材料 | 第39页 |
| 2.1.1 菌株 | 第39页 |
| 2.1.2 载体 | 第39页 |
| 2.1.3 酶和生化试剂 | 第39-40页 |
| 2.1.4 引物 | 第40页 |
| 2.1.5 培养基 | 第40页 |
| 2.1.6 抗生素 | 第40-41页 |
| 2.1.7 溶液和缓冲液 | 第41页 |
| 2.2 实验方法 | 第41-67页 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取 | 第41-42页 |
| 2.2.2 RNA含量与纯度检测 | 第42页 |
| 2.2.3 去除基因组DNA | 第42页 |
| 2.2.4 基因的克隆 | 第42-43页 |
| 2.2.5 PCR产物回收 | 第43页 |
| 2.2.6 连接反应 | 第43-44页 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态的制备和转化 | 第44页 |
| 2.2.8 测序 | 第44页 |
| 2.2.9 质粒DNA的提取 | 第44-45页 |
| 2.2.10 质粒DNA的酶切反应 | 第45页 |
| 2.2.11 表达载体的构建 | 第45-47页 |
| 2.2.11.1 MdbHLH104、MdBT1/2、MdbHLH105/115/11/121、MdPYE、MdCUL3等过量表达载体的构建 | 第45-46页 |
| 2.2.11.2 MdbHLH104、MdBT1/2、MdbHLH105/115/11/121、MdPYE、MdCUL3沉默载体的构建 | 第46页 |
| 2.2.11.4 启动子载体构建 | 第46-47页 |
| 2.2.11.5 原核表达载体的构建 | 第47页 |
| 2.2.11.6 酵母双杂交载体构建 | 第47页 |
| 2.2.12 农杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第47-48页 |
| 2.2.13 植物材料的准备及转化 | 第48-49页 |
| 2.2.13.1 苹果王林愈伤组织的培养 | 第48页 |
| 2.2.13.2 苹果愈伤组织的转化 | 第48页 |
| 2.2.13.3 嘎啦苹果遗传转化 | 第48-49页 |
| 2.2.14 酵母双杂 | 第49-52页 |
| 2.2.14.1 试剂的配制 | 第49-51页 |
| 2.2.14.2 酵母双杂交步骤 | 第51-52页 |
| 2.2.15 染色质免疫共沉淀(ChIP) | 第52-54页 |
| 2.2.15.1 所需的试剂 | 第52页 |
| 2.2.15.2 染色质的交联 | 第52-54页 |
| 2.2.16 凝胶变动迁移率(EMSA) | 第54-56页 |
| 2.2.16.1 EMSA探针制备 | 第54-55页 |
| 2.2.16.2 DNA探针与蛋白质结合 | 第55页 |
| 2.2.16.3 制备非变性聚丙烯酰胺凝胶 | 第55页 |
| 2.2.16.3.1 电泳缓冲液10×TBE(1000ml)的配制 | 第55页 |
| 2.2.16.3.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制 | 第55页 |
| 2.2.16.4 电泳和转膜 | 第55-56页 |
| 2.2.16.5 洗膜和显影 | 第56页 |
| 2.2.17 蛋白相关的实验技术 | 第56-59页 |
| 2.2.17.1 原核诱导 | 第56页 |
| 2.2.17.2 蛋白的纯化 | 第56-57页 |
| 2.2.17.3 Pull-Down | 第57页 |
| 2.2.17.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第57-59页 |
| 2.2.18 植物总蛋白的提取 | 第59页 |
| 2.2.19 蛋白免疫印迹(Western blotting) | 第59-60页 |
| 2.2.19.1 转膜 | 第59页 |
| 2.2.19.2 洗膜和显影 | 第59-60页 |
| 2.2.20 蛋白泛素化检测 | 第60-62页 |
| 2.2.20.1 体外降解 | 第60页 |
| 2.2.20.2 活体泛素化检测 | 第60-61页 |
| 2.2.20.3 活体泛素化检测 | 第61-62页 |
| 2.2.21 GUS组织化学染色 | 第62-64页 |
| 2.2.21.1 X-Gluc的配制 | 第62页 |
| 2.2.21.2 GUS染色 | 第62页 |
| 2.2.21.3 GUS酶活性的测定 | 第62-64页 |
| 2.2.21.3.1 试剂的配制 | 第62-63页 |
| 2.2.21.3.2 植物材料GUS蛋白的提取 | 第63页 |
| 2.2.21.3.3 GUS提取液中蛋白含量的测定 | 第63-64页 |
| 2.2.22 质膜H~+-ATPase酶活的测定 | 第64-65页 |
| 2.2.22.1 质膜H~+-ATPase酶的提取 | 第64-65页 |
| 2.2.22.2 质膜H~+-ATPase酶H~+转运活性的测定 | 第65页 |
| 2.2.23 外泌H~+的染色 | 第65-67页 |
| 3 结果分析 | 第67-108页 |
| 3.1 MdbHLH104功能鉴定 | 第67-71页 |
| 3.1.1 MdbHLH104序列及表达分析 | 第67-68页 |
| 3.1.2 MdbHLH104载体构建和转基因材料的获得 | 第68-69页 |
| 3.1.3 MdbHLH104表型分析 | 第69-71页 |
| 3.2 MdbHLH104调控MdAHA8影响PM H~+-ATP酶的活性 | 第71-79页 |
| 3.2.1 苹果MdAHAs基因家族成员鉴定 | 第71-72页 |
| 3.2.2 MdbHLH104上调MdAHA8基因的表达 | 第72-73页 |
| 3.2.3 MdbHLH104正调控MdAHA8基因的表达 | 第73-75页 |
| 3.2.4 MdbHLH104转基因王林愈伤表型鉴定 | 第75页 |
| 3.2.5 MdbHLH104通过MdAHA8调控质子外泌 | 第75-79页 |
| 3.3 MdbHLH104互作蛋白的筛选 | 第79-80页 |
| 3.4 MdbHLH104与苹果中I Vc亚家族其他基因互作 | 第80-86页 |
| 3.4.1 MdbHLH104与苹果中I Vc亚家族其他基因互作促进MdAHA8的转录 | 第81-83页 |
| 3.4.2 共表达MdbHLH104与苹果中I Vc亚家族其他基因促进质子外泌和铁离子的吸收. | 第83-85页 |
| 3.4.3 ChIP-PCR验证MdbHLH104直接结合到I b和I Vc亚家族bHLH转录因子启动子 | 第85-86页 |
| 3.5 MdbHLH104与苹果中BTB-TAZ骨架蛋白互作 | 第86-107页 |
| 3.5.1 苹果中BTB-TAZ蛋白 | 第86-88页 |
| 3.5.2 MdbHLH104与MdBTB-TAZ蛋白互作 | 第88-91页 |
| 3.5.3 MdBT1/2蛋白负调控MdbHLH104蛋白的积累 | 第91-95页 |
| 3.5.4 MdbHLH104蛋白发生26S蛋白酶体降解 | 第95-96页 |
| 3.5.5 MdBT1/2蛋白与MdCUL3互作 | 第96-97页 |
| 3.5.6 MdBT2蛋白促进MdbHLH104泛素化降解 | 第97-99页 |
| 3.5.7 MdCUL3负调控MdbHLH104蛋白的积累 | 第99-102页 |
| 3.5.8 MdCUL3通过MdBT1/2介导MdbHLH104蛋白的泛素化降解 | 第102-104页 |
| 3.5.9 MdBT2通过MdbHLH104负调控PM H~+-ATPase和铁离子平衡 | 第104-107页 |
| 3.6 铁离子抑制MdBTs蛋白的积累 | 第107-108页 |
| 4 讨论 | 第108-116页 |
| 4.1 MdbHLH104调控MdAHA8影响PM H~+-ATP酶的活性 | 第108-110页 |
| 4.2 MdbHLH104与IVc亚家族的其他bHLH转录因子互作 | 第110-111页 |
| 4.3 过量表达MdbHLH104引起苹果铁中毒 | 第111-112页 |
| 4.4 MdbHLH104与BTB-TAZ蛋白互作,调控其蛋白稳定性 | 第112-116页 |
| 5 结论 | 第116-117页 |
| 6 参考文献 | 第117-131页 |
| 7 附录 | 第131-137页 |
| 8 致谢 | 第137-138页 |
| 9 攻读学位期间发表的论文 | 第138-139页 |
