| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-33页 |
| 1.1 异丁醇及生物法合成 | 第11-13页 |
| 1.1.1 异丁醇的基本性质 | 第11页 |
| 1.1.2 异丁醇具有多功能与用途 | 第11-12页 |
| 1.1.3 生物合成异丁醇的研究现状 | 第12-13页 |
| 1.2 异丁醇合成菌株构建理性指导方法——系统生物学 | 第13-26页 |
| 1.2.1 系统生物学 | 第14页 |
| 1.2.2 基因组尺度代谢网络模型 | 第14-18页 |
| 1.2.3 代谢组学 | 第18-22页 |
| 1.2.4 异丁醇合成菌株的系统生物学研究现状 | 第22-26页 |
| 1.3 大肠杆菌的氧化还原辅因子代谢工程改造 | 第26-29页 |
| 1.3.1 宿主自身辅因子合成途径的工程改造 | 第26-27页 |
| 1.3.2 NADH和NADPH的相互转化改造 | 第27-28页 |
| 1.3.3 异源氧化还原辅因子依赖型酶的过表达 | 第28-29页 |
| 1.4 大肠杆菌的残糖代谢通路代谢工程改造 | 第29-31页 |
| 1.4.1 葡萄糖转运系统及其改造 | 第29-30页 |
| 1.4.2 胞内葡萄糖的分解代谢途径改造 | 第30-31页 |
| 1.5 本文的主要研究内容及技术路线 | 第31-33页 |
| 第2章 大肠杆菌异丁醇合成菌株还原力代谢模型 | 第33-63页 |
| 2.1 实验材料 | 第34-38页 |
| 2.1.1 菌种、质粒及引物 | 第34-35页 |
| 2.1.2 培养基 | 第35-36页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第36-37页 |
| 2.1.4 主要溶液 | 第37页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第37-38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-43页 |
| 2.2.1 大肠杆菌化学感受态细胞制备 | 第38-39页 |
| 2.2.2 大肠杆菌化学转化 | 第39页 |
| 2.2.3 细菌基因组提取 | 第39页 |
| 2.2.4 碱裂法提取大肠杆菌质粒 | 第39-40页 |
| 2.2.5 DNA片段的回收和纯化 | 第40页 |
| 2.2.6 大肠杆菌电转化感受态的制备以及电转化 | 第40-41页 |
| 2.2.7 DNA片段的PCR扩增方法 | 第41页 |
| 2.2.8 DNA片段酶切方法 | 第41-42页 |
| 2.2.9 DNA片段连接方法 | 第42页 |
| 2.2.10 琼脂糖凝胶电泳 | 第42-43页 |
| 2.2.11 大肠杆菌异丁醇合成菌株培养条件 | 第43页 |
| 2.2.12 菌体浓度、生物量及葡萄糖含量测定 | 第43页 |
| 2.2.13 代谢产物含量测定方法 | 第43页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第43-62页 |
| 2.3.1 大肠杆菌异丁醇合成初始菌株构建 | 第43-51页 |
| 2.3.2 基因组尺度还原力代谢网络模型构建与验证 | 第51-52页 |
| 2.3.3 还原力代谢模拟分析与候选靶点筛选 | 第52-56页 |
| 2.3.4 还原力代谢调节靶点预测 | 第56-62页 |
| 2.4 小结 | 第62-63页 |
| 第3章 模型驱动的还原力靶点理性改造 | 第63-83页 |
| 3.1 实验材料 | 第64-66页 |
| 3.1.1 菌种、质粒与引物 | 第64-65页 |
| 3.1.2 培养基 | 第65页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第65-66页 |
| 3.1.4 主要溶液 | 第66页 |
| 3.1.5 实验仪器 | 第66页 |
| 3.2 实验方法 | 第66-70页 |
| 3.2.1 GAPDH酶活性测定方法 | 第66-67页 |
| 3.2.2 异丁醇合成菌株胞内还原力辅因子的测定方法 | 第67-68页 |
| 3.2.3 Real-Time荧光定量PCR | 第68-70页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第70-81页 |
| 3.3.1 高效的依赖于NADP的甘油醛3磷酸代谢通路的构建 | 第71-75页 |
| 3.3.2 人工组成型启动子调节异丁醇合成菌株胞内还原力平衡 | 第75-78页 |
| 3.3.3 异丁醇合成菌株LA09发酵特征 | 第78-81页 |
| 3.4 小结 | 第81-83页 |
| 第4章 代谢组学理性揭示异丁醇合成菌株残糖代谢关键途径 | 第83-99页 |
| 4.1 实验材料 | 第84-85页 |
| 4.1.1 菌种 | 第84页 |
| 4.1.2 培养基 | 第84页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第84页 |
| 4.1.4 主要溶液 | 第84-85页 |
| 4.1.5 实验仪器 | 第85页 |
| 4.2 实验方法 | 第85-87页 |
| 4.2.1 代谢物样品制备 | 第85-86页 |
| 4.2.2 胞内代谢物GC-MS检测方法 | 第86页 |
| 4.2.3 胞内代谢物LC-MS检测方法 | 第86-87页 |
| 4.2.4 代谢物数据处理和统计分析 | 第87页 |
| 4.3 结果和讨论 | 第87-98页 |
| 4.3.1 不同初始糖浓度下的异丁醇合成菌株代谢行为 | 第87-89页 |
| 4.3.2 异丁醇合成菌株胞内代谢物检测与分析 | 第89-92页 |
| 4.3.3 多元统计分析异丁醇合成菌株胞内代谢差异 | 第92-95页 |
| 4.3.4 残糖转化关键限制因素分析 | 第95-98页 |
| 4.4 小结 | 第98-99页 |
| 第5章 理性构建高效“环保型”异丁醇合成菌株 | 第99-119页 |
| 5.1 实验材料 | 第100-103页 |
| 5.1.1 菌种、质粒与引物 | 第100页 |
| 5.1.2 培养基 | 第100页 |
| 5.1.3 主要试剂 | 第100页 |
| 5.1.4 主要溶液 | 第100页 |
| 5.1.5 实验仪器 | 第100-103页 |
| 5.2 实验方法 | 第103-104页 |
| 5.2.1 融合PCR | 第103-104页 |
| 5.2.2 Red-Xer系统同源重组 | 第104页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第104-118页 |
| 5.3.1 理性设计高效残糖转化合成ED途径 | 第104-107页 |
| 5.3.2 构建整合型人工ED合成途径的异丁醇合成菌株 | 第107-109页 |
| 5.3.3 初始人工ED合成途径的异丁醇合成菌株代谢特征 | 第109-112页 |
| 5.3.4 异丁醇合成菌株中人工ED合成途径调节 | 第112-116页 |
| 5.3.5 异丁醇合成菌株E.coli ED02发酵特征 | 第116-118页 |
| 5.4 小结 | 第118-119页 |
| 第6章 结论与展望 | 第119-121页 |
| 6.1 主要结论 | 第119-120页 |
| 6.2 创新点 | 第120页 |
| 6.3 展望 | 第120-121页 |
| 参考文献 | 第121-135页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第135-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
