| 中文摘要 | 第4-6页 |
| 英文摘要 | 第6页 |
| 1 前言 | 第11-22页 |
| 1．1 hGM-CSF研究 | 第11-17页 |
| 1．1．1 hGM-CFS的产生 | 第11-12页 |
| 1．1．2 hGM-CFS的基因结构和蛋白特性 | 第12-13页 |
| 1．1．3 hGM-CSF的生物学活性 | 第13-14页 |
| 1．1．4 hGM-CSF的受体 | 第14-15页 |
| 1．1．5 hGM-CSF的临床应用 | 第15页 |
| 1．1．6 国内外rhGM-CSF研究和开发概况 | 第15-17页 |
| 1．2 外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究概况 | 第17-20页 |
| 1．2．1 P．Pastoris是一种甲醇营养型酵母 | 第18页 |
| 1．2．2 外源蛋白的分泌 | 第18页 |
| 1．2．3 常用的表达菌株 | 第18-19页 |
| 1．2．4 质粒载体 | 第19-20页 |
| 1．2．5 高密度发酵的探索 | 第20页 |
| 1．3 本文的主要工作 | 第20-21页 |
| 1．4 选题依据和意义 | 第21-22页 |
| 2 实验方法 | 第22-31页 |
| 2．1 质粒和菌株 | 第22-23页 |
| 2．1．1 质粒和菌株 | 第22页 |
| 2．1．2 培养基和培养 | 第22页 |
| 2．1．3 酶与试剂 | 第22页 |
| 2．1．4 仪器 | 第22-23页 |
| 2．2 实验方法 | 第23-31页 |
| 2．2．1 PCR扩增hGM-CSF基因和Mutant hGM-CSF基因 | 第23页 |
| 2．2．2 PCR产物的回收与纯化 | 第23页 |
| 2．2．3 PCR产物的酶切 | 第23页 |
| 2．2．4 PCR产物酶切后的回收 | 第23-24页 |
| 2．2．5 质粒pPIC9K的酶切反应 | 第24页 |
| 2．2．6 连接与转化 | 第24-25页 |
| 2．2．7 质粒的大量及小量制备 | 第25页 |
| 2．2．8 转化毕赤甲醇酵母 | 第25-26页 |
| 2．2．9 细胞内G418抗性筛选高拷贝转化菌株 | 第26-27页 |
| 2．2．10 PCR法筛选转化子克隆 | 第27页 |
| 2．2．11 重组酵母菌株的表达 | 第27页 |
| 2．2．12 SDS--PAGE电泳检测酵母表达的目的蛋白 | 第27-28页 |
| 2．2．13 Western Blot抗原特异性检测 | 第28-29页 |
| 2．2．14 重组及野生型GM---CSF的分离纯化 | 第29页 |
| 2．2．15 蛋白质浓度的测定 | 第29页 |
| 2．2．16 重组及野生型GM-CSF生物活性测定 | 第29页 |
| 2．2．17 重组变异GM-CSF发酵工艺的研究 | 第29-31页 |
| 3 实验结果 | 第31-47页 |
| 3．1 hGM-CSF分泌型表达载体的构建、克隆与鉴定 | 第31-39页 |
| 3．1．1 hGM-CSF分泌型表达载体的构建 | 第31-36页 |
| 3．1．2 hGM---CSF重组克隆的鉴定 | 第36-39页 |
| 3．2 筛选转化毕赤甲醇酵母的转化子及高表达菌株 | 第39-43页 |
| 3．2．1 毕赤甲醇酵母转化子的筛选 | 第40-41页 |
| 3．2．2 高表达菌株的抗性筛选 | 第41-42页 |
| 3．2．3 hGM-CSF基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第42-43页 |
| 3．3 表达产物的Western Blot检测 | 第43页 |
| 3．4 影响hGM-CSF基因分泌表达因素的初步研究 | 第43-47页 |
| 3．4．1 分泌表达曲线 | 第43-45页 |
| 3．4．2 转接量与诱导培养方式的改变对表达的影响 | 第45页 |
| 3．4．3 转接量与诱导培养方式的改变对表达的影响 | 第45-46页 |
| 3．4．4 培养液增加缓冲能力后对分泌表达的影响 | 第46页 |
| 3．4．5 消泡剂对分泌表达的影响 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-53页 |
| 4．1 外源蛋白分泌表达的优点、限制因素及对策 | 第47-51页 |
| 4．1．1 外源蛋白分泌表达的优点 | 第47-48页 |
| 4．1．2 影响外源蛋白分泌表达的因素 | 第48-51页 |
| 4．2 细胞因子发展的新趋势-融合蛋白 | 第51-53页 |
| 5 小结 | 第53-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-59页 |
| 附录 | 第59页 |
