| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 1 研究背景 | 第17-48页 |
| 1.1 双生病毒研究进展 | 第17-23页 |
| 1.1.1 双生病毒的危害及重要性 | 第17-18页 |
| 1.1.2 双生病毒的基因组及其编码的蛋白 | 第18-23页 |
| 1.2 双生病毒与RNA沉默 | 第23-36页 |
| 1.2.1 RNA沉默的机制 | 第24-26页 |
| 1.2.2 病毒诱发的RNA沉默及编码的RNA沉默抑制子 | 第26-29页 |
| 1.2.3 双生病毒诱发的RNA沉默 | 第29-31页 |
| 1.2.4 双生病毒编码的沉默抑制子及作用机理 | 第31-36页 |
| 1.3 HDA6蛋白的研究进展 | 第36-47页 |
| 1.3.1 HDA6的分类地位 | 第37-41页 |
| 1.3.2 HDA6的功能研究 | 第41-47页 |
| 1.4 本项目的研究目的和意义 | 第47-48页 |
| 2 番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)编码的转录水平基因沉默抑制子的筛选与鉴定 | 第48-70页 |
| 2.1 材料与方法 | 第48-60页 |
| 2.1.1 材料 | 第48-49页 |
| 2.1.2 PVX重组表达载体的构建 | 第49页 |
| 2.1.3 重组质粒导入根癌农杆菌 | 第49-50页 |
| 2.1.4 农杆菌浸润 | 第50页 |
| 2.1.5 植物样品拍照与采集 | 第50页 |
| 2.1.6 RNA的提取及Northern blot分析 | 第50-52页 |
| 2.1.7 植物可溶性总蛋白的提取、SDS-PAGE及Western blot分析 | 第52-54页 |
| 2.1.8 转V2基因拟南芥植株的获得 | 第54-56页 |
| 2.1.9 亚硫酸氢盐测序 | 第56-58页 |
| 2.1.10 甲基化敏感性限制性内切酶PCR | 第58-60页 |
| 2.2 结果与分析 | 第60-68页 |
| 2.2.1 TYLCV能够回复转录水平沉默的GFP转基因 | 第60-62页 |
| 2.2.2 TYLCV编码的V2蛋白能够回复转录水平沉默的GFP转基因 | 第62页 |
| 2.2.3 TYLCV及其编码的V2蛋白能够抑制16-TGS植株35S启动子的甲基化 | 第62-65页 |
| 2.2.4 转V2拟南芥的获得及V2高表达植株的筛选 | 第65-66页 |
| 2.2.5 V2干扰拟南芥内源表观沉默位点的甲基化 | 第66-67页 |
| 2.2.6 V2抑制PTGS活性丧失突变体C84S/C86S依然能够抑制TGS | 第67-68页 |
| 2.3 讨论 | 第68-70页 |
| 3 与TYLCV V2蛋白互作的本氏烟寄主因子的筛选 | 第70-85页 |
| 3.1 材料与方法 | 第70-78页 |
| 3.1.1 材料 | 第70页 |
| 3.1.2 诱饵蛋白毒性及自激活检测 | 第70-71页 |
| 3.1.3 酵母双杂交筛库 | 第71-73页 |
| 3.1.4 同源序列比对及功能域分析 | 第73页 |
| 3.1.5 酵母双杂交实验 | 第73-74页 |
| 3.1.6 双分子荧光互补实验(BiFC) | 第74页 |
| 3.1.7 原核蛋白的表达与纯化 | 第74-76页 |
| 3.1.8 体外GST pull down实验 | 第76-78页 |
| 3.2 结果与分析 | 第78-83页 |
| 3.2.1 V2蛋白对酵母的毒性及其自激活检测 | 第78页 |
| 3.2.2 与V2蛋白互作的本氏烟寄主因子的筛选 | 第78页 |
| 3.2.3 本氏烟NbHDA6与其他植物HDA6同源性比对及保守结构域分析 | 第78-80页 |
| 3.2.4 酵母双杂交验证V2与NbHDA6蛋白的互作 | 第80-81页 |
| 3.2.5 BiFC验证V2与NbHDA6蛋白的互作 | 第81-82页 |
| 3.2.6 GST pull down验证V2与NbHDA6蛋白的互作 | 第82-83页 |
| 3.3 讨论 | 第83-85页 |
| 4 V2与NbHDA6蛋白互作机理的研究 | 第85-113页 |
| 4.1 材料与方法 | 第85-96页 |
| 4.1.1 材料 | 第85页 |
| 4.1.2 共聚焦观察NbHDA6的亚细胞定位 | 第85-86页 |
| 4.1.3 半定量RT-PCR及Real time RT-PCR分析 | 第86-88页 |
| 4.1.4 NbHDA6转基因回补拟南芥的获得 | 第88-89页 |
| 4.1.5 植物组蛋白提取及H3、H4乙酰化水平检测 | 第89页 |
| 4.1.6 基于TRV载体的基因沉默 | 第89-90页 |
| 4.1.7 植物DNA的提取及Southern blot分析 | 第90-93页 |
| 4.1.8 原核蛋白的表达与纯化 | 第93页 |
| 4.1.9 HDAC活性检测 | 第93-94页 |
| 4.1.10 体外竞争性GST pull down实验 | 第94-96页 |
| 4.2 结果与分析 | 第96-109页 |
| 4.2.1 NbHDA6组织特异性表达及亚细胞定位分析 | 第96-97页 |
| 4.2.2 NbHDA6能够回补AtHDA6的功能 | 第97-100页 |
| 4.2.3 TYLCV或V2的侵染影响NbHDA6 mRNA的积累 | 第100页 |
| 4.2.4 NbHDA6影响TYLCV的致病性 | 第100-102页 |
| 4.2.5 NbHDA6影响TYLCV的甲基化 | 第102-104页 |
| 4.2.6 V2蛋白不影响NbHDA6的去乙酰化酶活性 | 第104-106页 |
| 4.2.7 GST pull down验证NbHDA6与NbMET1蛋白的互作 | 第106-108页 |
| 4.2.8 V2与NbMET1蛋白竞争结合NbHDA6 | 第108-109页 |
| 4.3 讨论 | 第109-113页 |
| 5 附录Ⅰ 中国番茄黄化曲叶病毒引起的烟粉虱miRNA群体变异研究 | 第113-132页 |
| 5.1 研究背景 | 第113-115页 |
| 5.2 材料与方法 | 第115-121页 |
| 5.2.1 材料 | 第115页 |
| 5.2.2 烟粉虱获毒 | 第115页 |
| 5.2.3 烟粉虱AGO1和DCL1基因的克隆鉴定 | 第115页 |
| 5.2.4 烟粉虱小RNA(Small RNA,sRNA)文库的构建 | 第115-117页 |
| 5.2.5 RT-PCR扩增sRNA | 第117-118页 |
| 5.2.6 sRNA文库的纯化及高通量测序 | 第118页 |
| 5.2.7 保守miRNA的鉴定 | 第118页 |
| 5.2.8 新miRNA的预测 | 第118-119页 |
| 5.2.9 Real time RT-PCR分析 | 第119页 |
| 5.2.10 靶标预测和Gene Ontology(GO)分析 | 第119-121页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第121-130页 |
| 5.3.1 烟粉虱AGO1和DCL1基因的克隆 | 第121-122页 |
| 5.3.2 烟粉虱中sRNA的分布 | 第122-124页 |
| 5.3.3 带毒与健康烟粉虱中保守miRNA的差异表达 | 第124-126页 |
| 5.3.4 新miRNA候选基因的预测 | 第126页 |
| 5.3.5 Real time RT-PCR验证miRNA深度测序数据 | 第126-128页 |
| 5.3.6 miRNA靶标预测与Gene Ontology分析 | 第128-130页 |
| 5.4 小结 | 第130-132页 |
| 附录Ⅱ 参考文献 | 第132-153页 |
| 附录Ⅲ 本论文所用缩写词及中英文对照 | 第153-157页 |
| 附录Ⅳ 本论文所用病毒缩写及中英文对照 | 第157-159页 |
| 附录Ⅴ 常用缓冲液及培养基配方 | 第159-166页 |
| 作者简历及攻读博士学位期间已发表论文 | 第166页 |
