| 中文摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-7页 |
| 引言 | 第7-9页 |
| 第一章 材料及试剂 | 第9-18页 |
| ·实验材料 | 第9页 |
| ·主要仪器设备 | 第9页 |
| ·实验试剂及其配制 | 第9-18页 |
| ·主要试剂 | 第9-11页 |
| ·质粒菌株及细胞 | 第11页 |
| ·培养基的配制 | 第11-13页 |
| ·实验动物 | 第13页 |
| ·实验中所用引物 | 第13-15页 |
| ·技术路线 | 第15-18页 |
| 第二章 实验方法 | 第18-36页 |
| ·烟曲霉B5233孢子的收集 | 第18页 |
| ·烟曲霉B5233基因组DNA的提取 | 第18页 |
| ·烟曲霉磷脂酶D的聚合酶链反应 | 第18-19页 |
| ·pDHt/SK.2质粒的提取和纯化 | 第19-20页 |
| ·pDht/SK.2质粒(磷脂酶DPCR产物)的双酶切及其凝胶回收 | 第20-21页 |
| ·pDHt/SK.2大分子片段和pld的连接 | 第21页 |
| ·重组质粒pDht/Afpld的转化 | 第21页 |
| ·PLD菌液PCR | 第21-22页 |
| ·pDht/Afpld质粒的双酶切验证 | 第22页 |
| ·根癌农杆菌感受态的制备 | 第22页 |
| ·重组质粒pDHt/afpld：：hph转化根癌农杆菌 | 第22页 |
| ·根癌农杆菌介导的烟曲霉转化 | 第22-23页 |
| ·Southern blot探针的制备 | 第23页 |
| ·Southern blot检测 | 第23-25页 |
| ·休眠孢子和萌发孢子PLD活性测定 | 第25-26页 |
| ·孢子萌发率测定 | 第26页 |
| ·生长速率测定 | 第26页 |
| ·菌丝干重测量 | 第26页 |
| ·生物膜定量测定 | 第26页 |
| ·侵染实验 | 第26-27页 |
| ·孢子/菌丝粘附力测定 | 第27页 |
| ·PA回补剂量依赖实验 | 第27页 |
| ·1-丁醇处理孢子检测孢子活性 | 第27-28页 |
| ·烟曲霉孢子刺激上皮细胞ROS的释放测定 | 第28页 |
| ·烟曲霉孢子刺激上皮细胞MTT测定 | 第28页 |
| ·扫描电镜观察孢子的形态 | 第28页 |
| ·烟曲霉刺激A549细胞炎症因子mRNA的表达 | 第28-30页 |
| ·动物基本实验技术 | 第30-31页 |
| ·醋酸氢化可的松免疫抑制小鼠模型致死率 | 第31页 |
| ·环磷酰胺免疫抑制小鼠模型致死率 | 第31-32页 |
| ·醋酸氢化可的松免疫抑制小鼠模型病理进程分析 | 第32-33页 |
| ·环磷酰胺免疫抑制小鼠模型病理进程分析 | 第33-34页 |
| ·小鼠肺组织HE染色 | 第34页 |
| ·小鼠肺组织PAS染色 | 第34-35页 |
| ·统计学分析 | 第35-36页 |
| 第三章 实验结果 | 第36-68页 |
| ·烟曲霉磷脂酶D生物信息学分析 | 第36-39页 |
| ·不同物种的磷脂酶D进化分析 | 第36-37页 |
| ·烟曲霉pld基因位于2号染色体上含有4个内含子 | 第37-38页 |
| ·烟曲霉pld基因只包含四个保守区域 | 第38-39页 |
| ·磷脂酶D活性位点示意图 | 第39页 |
| ·烟曲霉磷脂酶D敲除株及其回补株的构建 | 第39-46页 |
| ·烟曲霉基因组DNA提取及其pld、hph和ble的扩增 | 第40-41页 |
| ·磷脂酶D敲除株、回补株质粒构建示意图及其双酶切验证 | 第41-43页 |
| ·pld敲除株的筛选及其PCR初步验证 | 第43-44页 |
| ·pld回补株的筛选及其PCR初步验证 | 第44-45页 |
| ·Southern blot示意图及杂交图 | 第45-46页 |
| ·烟曲霉磷脂酶D敲除后性状及其功能研究 | 第46-58页 |
| ·萌发的敲除株孢子和菌丝胞内外磷脂酶D活性明显降低 | 第46-47页 |
| ·pld敲除不影响孢子萌发 | 第47-48页 |
| ·pld敲除不影响菌落的大体形态和生长速率 | 第48-50页 |
| ·pld敲除不影响菌丝干重及其生物膜的形成 | 第50-51页 |
| ·pld敲除不影响孢子的细微结构 | 第51-52页 |
| ·pld敲除株侵染A549能力下降 | 第52-53页 |
| ·pld敲除不影响J774对孢子的吞噬能力 | 第53-55页 |
| ·PLD抑制剂处理孢子实验结果和敲除株相似 | 第55-56页 |
| ·100μM的PA回补敲除株恢复其侵染能力 | 第56-57页 |
| ·敲除株诱导A549的IL-8和MCP-1的mRNA显著增高 | 第57-58页 |
| ·动物实验 | 第58-68页 |
| ·醋酸氢化可的松模型和环磷酰胺模型小鼠幸存率 | 第58-59页 |
| ·感染孢子2小时肺部真菌负荷没有差别 | 第59-60页 |
| ·感染72和120小时敲除株感染小鼠肺部真菌负荷减少 | 第60-63页 |
| ·两种小鼠模型肺组织切片HE染色 | 第63-65页 |
| ·两种小鼠模型肺组织切片坏死面积和数量分析 | 第65-66页 |
| ·两种动物模型肺组织PAS染色 | 第66-68页 |
| 第四章 讨论 | 第68-73页 |
| 结论 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-79页 |
| 综述 | 第79-94页 |
| 综述参考文献 | 第89-94页 |
| 博士研究生期间发表的文章 | 第94-95页 |
| 附录 | 第95-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
