| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 1 前言 | 第13-29页 |
| 1.1 杆状病毒 | 第13-17页 |
| 1.1.1 杆状病毒的基因结构及分类特征 | 第13-14页 |
| 1.1.2 杆状病毒发育循环史 | 第14-15页 |
| 1.1.3 杆状病毒主要囊膜蛋白 | 第15-17页 |
| 1.2 杆状病毒表达系统 | 第17-22页 |
| 1.2.1 杆状病毒表达系统概述 | 第17页 |
| 1.2.2 Bac to Bac系统 | 第17-18页 |
| 1.2.3 Invasin介导的DAP营养缺陷型Sw106菌株 | 第18-20页 |
| 1.2.4 杆状病毒多基因高效表达系统的构建 | 第20-22页 |
| 1.3 杆状病毒表面展示系统 | 第22-27页 |
| 1.3.1 杆状病毒表面展示系统概述 | 第22页 |
| 1.3.2 杆状病毒表面展示系统的原理 | 第22-23页 |
| 1.3.3 基于GP64蛋白的融合展示 | 第23-24页 |
| 1.3.4 基于VSV-G蛋白的融合展示 | 第24-25页 |
| 1.3.5 基于F膜蛋白的融合展示 | 第25-26页 |
| 1.3.6 其他蛋白的融合展示 | 第26页 |
| 1.3.7 杆状病毒表面展示系统的应用前景 | 第26-27页 |
| 1.4 本课题研究内容与意义 | 第27-29页 |
| 2 材料与方法 | 第29-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-30页 |
| 2.1.1 基因 | 第29页 |
| 2.1.2 质粒 | 第29页 |
| 2.1.3 菌株 | 第29页 |
| 2.1.4 细胞 | 第29页 |
| 2.1.5 分子生物学试剂 | 第29页 |
| 2.1.6 分子生物学试剂盒 | 第29-30页 |
| 2.1.7 细胞培养试剂 | 第30页 |
| 2.1.8 基因测序及合成 | 第30页 |
| 2.2 仪器和设备 | 第30-31页 |
| 2.3 分子生物学溶液和试剂配方 | 第31-32页 |
| 2.3.1 核酸电泳缓冲液 | 第31页 |
| 2.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳缓冲液 | 第31页 |
| 2.3.3 Western Blot缓冲液 | 第31页 |
| 2.3.4 抗生素溶液 | 第31-32页 |
| 2.3.5 其他试剂 | 第32页 |
| 2.4 培养基配方 | 第32页 |
| 2.4.1 细菌LB培养基 | 第32页 |
| 2.4.2 细胞Grace培养基 | 第32页 |
| 2.5 分子生物学方法 | 第32-37页 |
| 2.5.1 质粒小提 | 第32页 |
| 2.5.2 病毒基因组的提取 | 第32页 |
| 2.5.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| 2.5.4 逆转录反应（reverse transcription，RT） | 第33页 |
| 2.5.5 聚合酶链式反应 | 第33-34页 |
| 2.5.6 DNA酶切反应 | 第34-35页 |
| 2.5.7 DNA的鉴定与纯化回收 | 第35页 |
| 2.5.8 DNA连接反应 | 第35页 |
| 2.5.9 转化和转座 | 第35-36页 |
| 2.5.10 重组质粒的筛选与鉴定 | 第36页 |
| 2.5.11 SDS-PAGE电泳 | 第36-37页 |
| 2.5.12 蛋白质印记免疫鉴定 | 第37页 |
| 2.6 昆虫细胞培养方法 | 第37-38页 |
| 2.6.1 细胞的复苏 | 第37页 |
| 2.6.2 细胞的传代 | 第37页 |
| 2.6.3 细胞的冻存 | 第37-38页 |
| 2.7 重组杆状病毒的构建与传代 | 第38-39页 |
| 2.7.1 重组rSw106-inv菌株的构建 | 第38页 |
| 2.7.2 重组rSw106-inv菌株的筛选 | 第38页 |
| 2.7.3 重组杆状病毒的构建 | 第38-39页 |
| 2.7.4 重组杆状病毒的传代 | 第39页 |
| 2.8 Ac-Zeo-ph\Δp64的构建 | 第39-41页 |
| 2.8.1 同源重组基因TB1-Zeocin R-ph-TB2的构建 | 第39-40页 |
| 2.8.2 野生型r Sw106-inv菌株电转感受态细胞的制备 | 第40页 |
| 2.8.3 同源重组片段的电转化 | 第40页 |
| 2.8.4 Ac-Zeo-ph\Δp64的筛选和鉴定 | 第40-41页 |
| 2.9 Ac-Zeo-ph\Δp64应用于重组杆状病毒复制周期的研究 | 第41-42页 |
| 2.9.1 转移载体pF-ph-G的构建 | 第41页 |
| 2.9.2 重组Ac-Zeo-ph\Δp64-ph-G的构建 | 第41页 |
| 2.9.3 GP64蛋白延迟表达的重组杆状病毒构建 | 第41页 |
| 2.9.4 GP64蛋白延迟表达的重组杆状病毒生活史检测 | 第41-42页 |
| 2.10 Ac-Zeo-ph\Δp64应用于重组杆状病毒的表面展示效率检测 | 第42-44页 |
| 2.10.1 转移载体p F-p64sp-R64-ph-F-ph-G的构建 | 第42-43页 |
| 2.10.2 重组Ac-p64sp-R64-ph-F-ph-G和Ac-Zeo-ph\Δp64-p64sp-R64-ph-F-ph-G的构建 | 第43页 |
| 2.10.3 重组杆状病毒Ac BV-p64sp-R64-ph-F-ph-G和Ac BV-Zeo-ph\Δp64-p64sp-R64-ph-F-ph-G的构建 | 第43页 |
| 2.10.4 TCID50法 | 第43-44页 |
| 2.10.5 双荧光素酶表达量检测 | 第44页 |
| 2.11 应用Ac-Zeo-ph\Δp64开展VSV-G介导的融合展示研究 | 第44-46页 |
| 2.11.1 vsv-g基因与sf9细胞密码子使用频率比较 | 第44页 |
| 2.11.2 基于VSV-G蛋白融合修饰的载体系统的构建过程 | 第44-45页 |
| 2.11.3 VSV-G蛋白介导egfp单基因展示的重组杆状病毒构建 | 第45页 |
| 2.11.4 外源蛋白的展示检测 | 第45页 |
| 2.11.5 Western Blot鉴定重组杆状病毒的融合蛋白 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-67页 |
| 3.1 Ac-Zeo-ph\Δp64的构建 | 第46-48页 |
| 3.1.1 同源重组基因TB1-Zeocin R-ph-TB2的构建 | 第47页 |
| 3.1.2 Ac-Zeo-ph\Δp64的筛选 | 第47-48页 |
| 3.2 Ac-Zeo-ph\Δp64应用于重组杆状病毒的研究 | 第48-51页 |
| 3.2.1 转移载体p F-ph-G的构建 | 第48-49页 |
| 3.2.2 重组Ac-Zeo-ph\Δp64-ph-G的构建 | 第49-50页 |
| 3.2.3 GP64不同表达时序性重组杆状病毒的构建 | 第50页 |
| 3.2.4 GP64不同表达时序性表达重组杆状病毒的生活史检测 | 第50-51页 |
| 3.3 Ac-Zeo-ph\Δp64应用于重组杆状病毒的表面展示效率检测 | 第51-60页 |
| 3.3.1 转移载体p F-p64sp-R64-ph-F-ph-G的构建 | 第52-56页 |
| 3.3.2 重组Ac-p64sp-R64-ph-F-ph-G和Ac-Zeo-ph\Δp64-p64sp -R64-ph-F-ph-G的构建 | 第56页 |
| 3.3.3 重组杆状病毒Ac BV-p64sp-R64-ph-F-ph-G和Ac BV-Zeo-ph\Δp64-p64sp-R64-ph-F-ph-G的构建 | 第56-57页 |
| 3.3.4 TCID50法测定重组杆状病毒病毒滴度 | 第57-58页 |
| 3.3.5 双荧光素酶表达量检测 | 第58-60页 |
| 3.4 应用Ac-Zeo-ph\Δp64开展VSV-G介导的融合展示研究 | 第60-67页 |
| 3.4.1 vsv-g基因与sf9细胞密码子使用频率比较 | 第60-61页 |
| 3.4.2 转移载体p U-p64sp H-GV的构建 | 第61-64页 |
| 3.4.3 VSV-G蛋白介导egfp单基因展示重组杆状病毒的构建 | 第64-65页 |
| 3.4.4 外源蛋白表面展示效果检测及亚细胞定位 | 第65-66页 |
| 3.4.5 Western Blot 对包含荧光蛋白的子代杆状病毒鉴定 | 第66-67页 |
| 4 讨论与结论 | 第67-74页 |
| 4.1 讨论 | 第67-73页 |
| 4.1.1 杆状病毒表面展示效率 | 第67-69页 |
| 4.1.2 VSV-G蛋白介导的外源基因展示能力 | 第69-71页 |
| 4.1.3 GP64蛋白介导的重组杆状病毒出芽和入侵 | 第71-72页 |
| 4.1.4 杆状病毒多基因高效展示系统的建立及应用 | 第72-73页 |
| 4.2 结论 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-83页 |
| 附录 | 第83-89页 |
| 硕士期间发表论文 | 第89-90页 |
| 资助项目 | 第90页 |
