| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一部分 | 第13-43页 |
| 第一章 CRISPR-Cas9表达载体的构建 | 第13-26页 |
| 1 材料 | 第14页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第14页 |
| 1.2 化学试剂与耗材 | 第14页 |
| 1.3 实验材料 | 第14页 |
| 2 方法 | 第14-20页 |
| 2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞的分离与培养 | 第14-15页 |
| 2.2 电穿孔法转染绒山羊胎儿成纤维细胞 | 第15-16页 |
| 2.3 针对绒山羊MSTN基因CRISPR-Cas9系统的设计与构建 | 第16-20页 |
| 3 结果 | 第20-23页 |
| 3.1 绒山羊胎儿成纤维细胞的分离与培养 | 第20-21页 |
| 3.2 山羊胎儿成纤维细胞电穿孔法转染条件的优化 | 第21页 |
| 3.3 gRNA表达载体的构建 | 第21-22页 |
| 3.4 CRISPR/Cas9表达载体的质量检测 | 第22-23页 |
| 3.5 Surveyor突变检测试剂盒检测结果 | 第23页 |
| 4 讨论 | 第23-24页 |
| 参考文献 | 第24-26页 |
| 第二章 利用CRISPR-Cas9技术制备MSTN基因敲除的绒山羊胎儿成纤维细胞 | 第26-42页 |
| 1 材料 | 第27-29页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第27页 |
| 1.2 化学试剂与耗材 | 第27-28页 |
| 1.3 实验材料 | 第28页 |
| 1.4 溶液配制 | 第28-29页 |
| 2 方法 | 第29-34页 |
| 2.1 绒山羊骨骼肌卫星细胞的分离及培养 | 第29-30页 |
| 2.2 电穿孔法转染绒山羊胎儿成纤维细胞与骨骼肌肉卫星细胞 | 第30页 |
| 2.3 单克隆细胞系的获得 | 第30页 |
| 2.4 单克隆细胞系基因组的制备 | 第30-31页 |
| 2.5 阳性单克隆细胞系的鉴定 | 第31页 |
| 2.6 转基因绒山羊成纤维细胞RNA(Total RNA)的提取 | 第31-32页 |
| 2.7 Real-time PCR检测 | 第32-33页 |
| 2.8 Western blot检测MSTN基因的表达 | 第33-34页 |
| 3 结果 | 第34-40页 |
| 3.1 绒山羊骨骼肌肉卫星细胞的分离与培养 | 第34页 |
| 3.2 单克隆细胞系的制备 | 第34-35页 |
| 3.3 阳性单克隆细胞系的鉴定 | 第35-38页 |
| 3.4 实时定量PCR分析MSTN基因下调后肌肉发育相关基因的mRNA表达水平 | 第38-39页 |
| 3.5 Western blot检测MSTN基因的表达 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40页 |
| 参考文献 | 第40-42页 |
| 结论 | 第42-43页 |
| 第二部分 综述部分 | 第43-53页 |
| 1 新型基因组修饰平台 | 第43-46页 |
| 2 CRISPR/Cas系统的应用进展 | 第46-47页 |
| 3 CRISPR/Cas系统的构建方法与突变效率检测 | 第47-48页 |
| 4 CRISPR/Cas系统的脱靶效应和问题 | 第48-49页 |
| 5 结语 | 第49页 |
| 参考文献 | 第49-53页 |
| 致谢 | 第53页 |
