| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-14页 |
| 1 前言 | 第14-44页 |
| 1.1 古菌 | 第14-16页 |
| 1.2 硫化叶菌 | 第16-20页 |
| 1.2.1 硫化叶菌的发现 | 第16-17页 |
| 1.2.2 硫化叶菌的基因组测序 | 第17-18页 |
| 1.2.3 硫化叶菌的遗传操作体系 | 第18-20页 |
| 1.3 蛋白酶及其分类 | 第20-22页 |
| 1.4 启动和执行细胞程序性死亡的蛋白酶 | 第22-33页 |
| 1.4.1 细胞程序性死亡 | 第22-26页 |
| 1.4.2 Caspases | 第26-28页 |
| 1.4.3 Caspase-like蛋白 | 第28-31页 |
| 1.4.4 古菌PCD及其相关基因 | 第31-33页 |
| 1.5 硫化叶菌蛋白酶研究进展 | 第33-37页 |
| 1.5.1 硫化叶菌中的金属蛋白酶 | 第33-35页 |
| 1.5.2 硫化叶菌中的半胱氨酸蛋白酶 | 第35-36页 |
| 1.5.3 硫化叶菌中的丝氨酸蛋白酶 | 第36页 |
| 1.5.4 硫化叶菌中的天冬氨酸蛋白酶 | 第36-37页 |
| 1.6 TLDD和TLDE蛋白研究进展 | 第37-42页 |
| 1.7 研究的目的与意义 | 第42-44页 |
| 2 材料与方法 | 第44-70页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第44-45页 |
| 2.2 培养基配方和培养条件 | 第45-48页 |
| 2.2.1 LB(Luria-Bertani)培养基 | 第45页 |
| 2.2.2 硫化叶菌培养基 | 第45-48页 |
| 2.3 主要分子生物学或生化试剂 | 第48页 |
| 2.4 主要仪器设备 | 第48-49页 |
| 2.5 重组表达载体的构建 | 第49-54页 |
| 2.5.1 硫化叶菌总DNA的提取 | 第49页 |
| 2.5.2 引物的设计与合成 | 第49页 |
| 2.5.3 PCR扩增 | 第49-50页 |
| 2.5.4 T-A克隆 | 第50页 |
| 2.5.5 E. coli DH5α感受态的制备及酶连产物的化学转化 | 第50页 |
| 2.5.6 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第50-51页 |
| 2.5.7 质粒DNA的酶切与验证 | 第51页 |
| 2.5.8 表达载体的构建 | 第51-54页 |
| 2.6 点突变 | 第54页 |
| 2.7 重组蛋白的诱导表达与纯化 | 第54-58页 |
| 2.7.1 pET原核表达载体T7强启动子的诱导表达原理 | 第54-55页 |
| 2.7.2 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第55-56页 |
| 2.7.3 重组蛋白在硫化叶菌中的诱导表达 | 第56页 |
| 2.7.4 诱导表达培养物的预处理 | 第56页 |
| 2.7.5 用His-Gravitrap镍柱亲和层析纯化带His-tag的重组蛋白 | 第56-57页 |
| 2.7.6 透析 | 第57页 |
| 2.7.7 包涵体复性 | 第57页 |
| 2.7.8 凝胶过滤 | 第57-58页 |
| 2.8 SDS-PAGE分析与凝胶成像 | 第58-60页 |
| 2.8.1 分离胶的灌制 | 第58页 |
| 2.8.2 浓缩胶的灌制 | 第58-59页 |
| 2.8.3 样品制备和上样 | 第59页 |
| 2.8.4 电泳、考染、脱色 | 第59页 |
| 2.8.5 银染、脱色 | 第59-60页 |
| 2.9 抗体制备 | 第60页 |
| 2.10 WESTERN BLOTTING | 第60-62页 |
| 2.10.1 Western blotting的原理 | 第60页 |
| 2.10.2 Western blotting的具体操作步骤 | 第60-62页 |
| 2.11 酶联免疫吸附测定(ELISA) | 第62-63页 |
| 2.11.1 酶联免疫吸附测定的原理 | 第62页 |
| 2.11.2 间接法ELISA的具体操作步骤 | 第62-63页 |
| 2.12 质谱分析 | 第63页 |
| 2.13 BCA法测定蛋白浓度 | 第63-64页 |
| 2.14 重组蛋白酶的活力测定 | 第64-66页 |
| 2.14.1 以FITC-BSA为底物的蛋白酶酶活测定 | 第64页 |
| 2.14.2 以azocasein为底物的蛋白酶酶活测定 | 第64页 |
| 2.14.3 蛋白酶活力染色法 | 第64-65页 |
| 2.14.4 相对酶活的计算方法 | 第65页 |
| 2.14.5 温度和pH值对酶活力的影响 | 第65页 |
| 2.14.6 金属离子对蛋白酶酶活的影响 | 第65-66页 |
| 2.14.7 蛋白酶抑制剂对蛋白酶酶活的影响 | 第66页 |
| 2.14.8 caspase活性分析 | 第66页 |
| 2.15 锌含量的测定 | 第66-67页 |
| 2.16 流式细胞分析和显微照相 | 第67页 |
| 2.17 共表达/共纯化分析蛋白复合物 | 第67-68页 |
| 2.17.1 共表达/共纯化及其原理 | 第67-68页 |
| 2.17.2 共表达/共纯化的具体操作步骤 | 第68页 |
| 2.18 免疫共沉淀分析蛋白质之间的相互作用 | 第68-70页 |
| 2.18.1 免疫共沉淀及其原理 | 第68页 |
| 2.18.2 免疫共沉淀具体操作步骤 | 第68-70页 |
| 3 结果与分析 | 第70-121页 |
| 3.1 Sso0660和Sso0661蛋白的序列分析和功能预测 | 第70-76页 |
| 3.1.1 Sso0660和Sso0661蛋白同属TldD超家族 | 第70页 |
| 3.1.2 预测Sso0660和Sso0661均为胞内蛋白 | 第70-71页 |
| 3.1.3 古菌与细菌TldD和TldE蛋白的多序列比对 | 第71-74页 |
| 3.1.4 泉古菌中TldD蛋白的多序列比对 | 第74页 |
| 3.1.5 TldD蛋白与真核生物DPPⅢ的多序列比对 | 第74-76页 |
| 3.2 Sso0660和Sso0661相关超表达基因工程菌株的构建 | 第76-86页 |
| 3.2.1 Sso0660和Sso0661基因的PCR扩增 | 第76页 |
| 3.2.2 Sso0660同源与异源超表达菌株的构建 | 第76-79页 |
| 3.2.3 Sso0661同源与异源超表达菌株的构建 | 第79-81页 |
| 3.2.4 Sso0660各突变的同源与异源超表达菌株的构建 | 第81-84页 |
| 3.2.5 Sso0660与Sso0661共表达同源超表达菌株的构建 | 第84-86页 |
| 3.3 Sso660和Sso0661蛋白的超表达、性质与功能分析 | 第86-121页 |
| 3.3.1 Sso0661异源超表达以包涵体为主 | 第86-87页 |
| 3.3.2 Sso0661同源超表达产物为可溶的单体形式 | 第87-90页 |
| 3.3.3 Sso0660的同源超表达与纯化 | 第90-91页 |
| 3.3.4 Sso0660异源超表达以包涵体为主 | 第91-92页 |
| 3.3.5 鼠抗重组Sso0660和鼠抗重组Sso0661抗体的制备 | 第92-93页 |
| 3.3.6 异源超表达Sso0660蛋白酶的二聚体化与切割成熟 | 第93-95页 |
| 3.3.7 异源超表达重组Sso0660为36聚体 | 第95-97页 |
| 3.3.8 重组Sso0660为高温中性蛋白酶 | 第97-99页 |
| 3.3.9 重组Sso0661蛋白展现微弱的蛋白水解活性 | 第99-101页 |
| 3.3.10 重组Sso0661蛋白酶不分解牛胰岛素B链 | 第101-102页 |
| 3.3.11 重组Sso0661蛋白酶为高温中性蛋白酶 | 第102-103页 |
| 3.3.12 重组Sso0660和Sso0661均展现金属蛋白酶活性 | 第103-104页 |
| 3.3.13 Sso0660同源超表达菌株出现生长受阻的表型 | 第104-106页 |
| 3.3.14 Sso0660的切割成熟与硫化叶菌胞内caspase活性增高相关 | 第106-108页 |
| 3.3.15 重组Sso0660蛋白酶展现caspase-8-like活性 | 第108-110页 |
| 3.3.16 重组Sso0661蛋白酶展现caspase-8-like的免疫活性 | 第110-111页 |
| 3.3.17 流式细胞分析Sso0660同源超表达菌株的PCD特征 | 第111-112页 |
| 3.3.18 共表达/共纯化证实Sso0660和Sso0661形成复合物 | 第112-113页 |
| 3.3.19 Co-IP证实Sso0660和Sso0661形成蛋白复合物 | 第113-114页 |
| 3.3.20 金属离子对重组Sso0660和Sso0661蛋白酶的影响 | 第114-116页 |
| 3.3.21 C_(416)参与Sso0660链间二硫键的形成 | 第116-118页 |
| 3.3.22 D278E改变Sso0660蛋白酶的切割与激活 | 第118页 |
| 3.3.23 "HExxxH"和"DDEG"模序与Sso0660的锌结合相关 | 第118-121页 |
| 4 讨论与展望 | 第121-129页 |
| 4.1 SSO0660和SSO0661可能参与反螺旋酶活性的调节 | 第121-122页 |
| 4.2 SSO0660的切割与激活机制 | 第122-125页 |
| 4.3 TLDD超家族与古菌的程序性死亡调控 | 第125-129页 |
| 参考文献 | 第129-139页 |
| 附录 | 第139-147页 |
| 附录1 文中所用引物 | 第139-140页 |
| 附录2 测序比对结果 | 第140-147页 |
| 博士期间学术成果 | 第147-148页 |
| 致谢 | 第148页 |
