| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 综述 | 第12-24页 |
| 1 神经酰胺酶的研究进展 | 第12-18页 |
| 1.1 酸性神经酰胺酶(Acid ceramidase,AC) | 第12-14页 |
| 1.2 中性神经酰胺酶(Neutral ceramidase,NC) | 第14-16页 |
| 1.3 碱性神经酰胺酶(Alkaline ceramidase,ACER) | 第16-18页 |
| 2 鞘磷脂酶的研究进展 | 第18-22页 |
| 2.1 酸性鞘磷脂酶(Acid sphingomyelinase,aSMase) | 第18-19页 |
| 2.2 分泌型鞘磷脂酶(Secretory sphingomyelinase,sSMase) | 第19-20页 |
| 2.3 中性鞘磷脂酶(Neutral sphingomyelinase,nSMase) | 第20-21页 |
| 2.4 碱性鞘磷脂酶(Alkaline sphingomyelinase,alkSMase) | 第21-22页 |
| 3 研究目的和意义 | 第22-24页 |
| 第二章 二化螟碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶基因的克隆及表达 | 第24-42页 |
| 1 实验材料 | 第25-26页 |
| 1.1 供试虫源 | 第25页 |
| 1.2 细胞系和真核表达系统 | 第25页 |
| 1.3 试剂 | 第25页 |
| 1.4 仪器设备 | 第25页 |
| 1.5 工具酶 | 第25-26页 |
| 1.6 试剂配制 | 第26页 |
| 2 实验方法 | 第26-34页 |
| 2.1 总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2 PCR引物设计 | 第27页 |
| 2.3 cDNA第一链合成 | 第27-28页 |
| 2.4 PCR扩增 | 第28页 |
| 2.5 PCR产物纯化 | 第28页 |
| 2.6 PCR产物平末端加A | 第28-29页 |
| 2.7 感受态细胞制备(CaCl_2法) | 第29页 |
| 2.8 连接转化 | 第29-30页 |
| 2.9 PCR方法鉴定阳性重组质粒 | 第30页 |
| 2.10 重组质粒pEASY-T-aCER和pEASY-T-nSMase的提取 | 第30-31页 |
| 2.11 重组杆状病毒转移质粒pFastBacHT-aCER和pFastBacHT-nSMase的构建 | 第31页 |
| 2.12 重组Bacmid的获得 | 第31-32页 |
| 2.13 pFastBacHT-aCER和pFastBacHT-nSMase在昆虫细胞中的表达 | 第32页 |
| 2.14 SDA-PAGE分析 | 第32-33页 |
| 2.15 Western blot分析 | 第33-34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-39页 |
| 3.1 二化螟碱性神经酰胺酶基因(saCER)的扩增及序列分析 | 第34-36页 |
| 3.2 二化螟中性鞘磷脂酶基因(snSMase)的扩增及序列分析 | 第36-37页 |
| 3.3 重组杆状病毒转移载体的构建 | 第37-38页 |
| 3.4 重组病毒的获得及鉴定 | 第38页 |
| 3.5 Western Blot分析 | 第38-39页 |
| 4 讨论 | 第39-42页 |
| 第三章 二化螟碱性神经酰胺酶的生化特征 | 第42-54页 |
| 1 实验材料 | 第43-45页 |
| 1.1 真核表达系统 | 第43页 |
| 1.2 试剂及其他 | 第43页 |
| 1.3 试剂配制 | 第43-44页 |
| 1.4 仪器设备 | 第44-45页 |
| 2 实验方法 | 第45-47页 |
| 2.1 sf9细胞复苏与冻存 | 第45页 |
| 2.2 microsomes提取 | 第45-46页 |
| 2.3 BCA测定蛋白浓度 | 第46页 |
| 2.4 二化螟碱性神经酰胺酶(saCER)酶活测定及HPLC分析 | 第46-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-52页 |
| 3.1 saCER跨膜结构预测 | 第47-49页 |
| 3.2 HPLC条件的建立 | 第49页 |
| 3.3 saCER神经酰胺酶活力测定 | 第49-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 第四章 二化螟中性鞘磷脂酶的生化特征 | 第54-62页 |
| 1 实验材料 | 第54-55页 |
| 1.1 真核表达系统 | 第54页 |
| 1.2 试剂及其他 | 第54页 |
| 1.3 试剂配制 | 第54-55页 |
| 1.4 仪器设备 | 第55页 |
| 2 实验方法 | 第55-56页 |
| 2.1 microsomes提取 | 第55页 |
| 2.2 BCA测定蛋白浓度 | 第55页 |
| 2.3 二化螟中性鞘磷脂酶(snSMase)酶活测定及HPLC分析 | 第55-56页 |
| 3 结果与分析 | 第56-60页 |
| 3.1 snSMase跨膜结构预测 | 第56-57页 |
| 3.2 HPLC条件的建立 | 第57页 |
| 3.3 snSMase鞘磷脂酶活力测定 | 第57-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| 第五章 saCER和snSMase的时空表达谱 | 第62-70页 |
| 1 实验材料 | 第63页 |
| 1.1 供试虫源 | 第63页 |
| 1.2 试剂 | 第63页 |
| 1.3 仪器 | 第63页 |
| 2 实验方法 | 第63-65页 |
| 2.1 样品准备 | 第63页 |
| 2.2 总RNA的提取 | 第63页 |
| 2.3 cDNA第一链的合成 | 第63-64页 |
| 2.4 引物设计 | 第64页 |
| 2.5 Real time-PCR体系建立 | 第64-65页 |
| 2.6 数据分析 | 第65页 |
| 3 结果与分析 | 第65-68页 |
| 3.1 实时定量PCR体系建立 | 第65-66页 |
| 3.2 saCER基因在二化螟体内的时空表达谱 | 第66-67页 |
| 3.3 snSMase基因在二化螟体内的表达时空表达谱 | 第67-68页 |
| 4 讨论 | 第68-70页 |
| 全文总结 | 第70-72页 |
| 创新点 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
