| 缩略词表 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-17页 |
| 材料与方法 | 第17-24页 |
| 1 材料 | 第17-18页 |
| ·菌株、细胞与质粒 | 第17页 |
| ·主要试剂 | 第17-18页 |
| ·主要仪器 | 第18页 |
| ·主要试剂配方 | 第18页 |
| 2 方法 | 第18-24页 |
| ·细胞培养及细胞冻存复苏 | 第18-19页 |
| ·CRISPR敲除HOIP细胞系的构建 | 第19-20页 |
| ·CRISPR靶序列设计 | 第19页 |
| ·lentiCRISPRv2-sg RNA敲除表达载体的构建及阳性克隆的筛选 | 第19页 |
| ·病毒包装 | 第19页 |
| ·嘌呤霉素对HeLa细胞的最小致死量筛选 | 第19页 |
| ·HeLa细胞的病毒感染及敲除效果检测 | 第19-20页 |
| ·CRISPR敲除HOIP的HeLa细胞中表达HOIP~(WT)和HOIP~(CS) | 第20-21页 |
| ·利用点突变方法构建pCDH-GFP-T2A-HOIP~(CS)质粒 | 第20页 |
| ·病毒包装 | 第20页 |
| ·病毒感染CRISPR敲除HOIP的He La细胞系 | 第20页 |
| ·病毒感染细胞的分选 | 第20-21页 |
| ·CRISPR敲除HOIP的HeLa细胞中转染pcDNA3.0-Myc-HOIP~(WT)/CS | 第21页 |
| ·免疫共沉淀方法检测线性泛素化修饰 | 第21页 |
| ·质谱鉴定 | 第21-23页 |
| ·统计学方法 | 第23-24页 |
| 实验结果 | 第24-39页 |
| 1 CRISPR稳定敲除HOIP的He La细胞系建立 | 第24-25页 |
| ·CRISPR稳定敲除HOIP的lentiCRISPRv2-sgRNA质粒的构建 | 第24页 |
| ·稳定敲除HOIP的HeLa细胞系的构建 | 第24-25页 |
| 2 利用CRISPR稳定敲除细胞系，构建用于LUBAC底物筛选的阳性细胞体系（HOIP~(WT)组和对照细胞体系HOIP~(CS)组） | 第25-28页 |
| ·pCDH-GFP-T2A-HOIP~(CS)质粒的构建 | 第25页 |
| ·稳定敲除HOIP的HeLa细胞中稳定表达外源HOIP~(WT)和HOIP~(CS) | 第25-26页 |
| ·稳定表达外源HOIP~(WT)和HOIP~(CS)体系中LUBAC已知底物NEMO线性泛素化的检测 | 第26-28页 |
| 3 瞬时表达HOIP~(WT)和HOIP~(CS)体系中NEMO线性泛素化的检测 | 第28-29页 |
| 4 质谱方法验证阳性体系的建立以及LUBAC底物的初步鉴定结果 | 第29-39页 |
| 讨论 | 第39-41页 |
| 总结 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-48页 |
| 附录 | 第48-248页 |
| 附录1 NEMO线性泛素化位点鉴定的原始谱图 | 第48-50页 |
| 附录2 LUBAC底物筛选对照组线性泛素化蛋白质谱鉴定结果 | 第50-135页 |
| 附录3 LUBAC底物筛选实验组线性泛素化蛋白质谱鉴定结果 | 第135-248页 |
| 个人简历 | 第248-249页 |
| 致谢 | 第249-250页 |
