| 目录 | 第1-8页 |
| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-31页 |
| 一、组蛋白修饰和高级染色质空间结构是真核基因表达调控的重要方式 | 第12-17页 |
| 1 染色质水平的调控是真核基因表达调控的重要方式 | 第12-13页 |
| 2 组蛋白修饰和高级染色质空间结构是染色质水平调控的重要方式 | 第13-17页 |
| 二、核基质结合蛋白结合MAR元件并参与基因转录、染色质修饰和高级染色质结构 | 第17-21页 |
| 1 MAR元件参与基因转录、染色质修饰和高级染色质结构 | 第17-18页 |
| 2 SATB1在胸腺细胞调控基因转录并组织染色质空间结构 | 第18-20页 |
| 3 SATB2在前B细胞和成骨细胞调控基因转录 | 第20-21页 |
| 三、真核基因表达调控经典模型β珠蛋白基因簇的染色质结构受到核基质结合蛋白的调节 | 第21-28页 |
| 1 β珠蛋白基因簇由上游LCR元件和下游具有发育阶段特异表达的珠蛋白基因组成 | 第21-26页 |
| 2 β珠蛋白基因簇开放时超敏位点和下游基因发生空间靠近形成活性染色质中心 | 第26页 |
| 3 核基质结合蛋白SATB1调节ε珠蛋白基因的表达并调控整个基因簇的空间结构 | 第26-28页 |
| 四、本研究的理论依据与实验设计 | 第28-31页 |
| 材料与方法 | 第31-60页 |
| 一、实验材料 | 第31-34页 |
| 1 菌株与质粒 | 第31页 |
| 2 细胞系及实验用小鼠 | 第31页 |
| 3 限制性内切酶及修饰酶 | 第31页 |
| 4 抗体 | 第31-32页 |
| 5 引物合成 | 第32页 |
| 6 其它主要试剂和材料 | 第32-33页 |
| 7 主要仪器设备 | 第33-34页 |
| 二、实验方法 | 第34-60页 |
| 1 本研究的基本技术路线 | 第34页 |
| 2 细菌操作与质粒的转化 | 第34-36页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5α制备 | 第34-35页 |
| ·质粒的转化 | 第35页 |
| ·质粒的提取和纯化 | 第35-36页 |
| 3. 实验中所用细胞的培养和处理 | 第36-41页 |
| ·细胞培养 | 第36页 |
| ·细胞传代 | 第36-37页 |
| ·细胞复苏及冻存 | 第37页 |
| ·K562细胞向红系诱导和检测 | 第37-38页 |
| ·K562细胞向红系分化诱导 | 第37页 |
| ·K562细胞红系分化的检测 | 第37-38页 |
| ·造血干细胞分离纯化和诱导培养 | 第38-39页 |
| ·单个核细胞分离和纯化 | 第38页 |
| ·CD34+造血祖细胞分离与诱导培养 | 第38页 |
| ·流式检测细胞表面抗原标记物 | 第38-39页 |
| ·Wright-Giemsa染色 | 第39页 |
| ·细胞转染 | 第39页 |
| ·逆转录病毒介导的细胞感染 | 第39-41页 |
| ·pMSCV逆转录病毒载体构建 | 第39-40页 |
| ·RNAi逆转录病毒载体构建 | 第40页 |
| ·逆转录病毒包装 | 第40页 |
| ·逆转录病毒感染靶细胞 | 第40-41页 |
| ·逆转录病毒感染后细胞筛选和混合克隆获得 | 第41页 |
| 4 小鼠胚胎组织分离 | 第41-42页 |
| 5 定量和半定量RT-PCR | 第42-43页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第42页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第42页 |
| ·RT-PCR检测 | 第42-43页 |
| 6 Western-Blotting | 第43-46页 |
| ·细胞总蛋白提取 | 第43页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第43-44页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第44页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶制备 | 第44页 |
| ·样品制备、上样与电泳 | 第44页 |
| ·转膜 | 第44-45页 |
| ·抗原抗体反应 | 第45页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白 | 第45页 |
| ·Western-Blotting中所用到的溶液 | 第45-46页 |
| 7 双荧光素酶报告系统检测 | 第46-47页 |
| ·细胞转染 | 第46-47页 |
| ·荧光测定 | 第47页 |
| 8 免疫荧光 | 第47-48页 |
| ·多聚甲醛固定 | 第47页 |
| ·增加细胞膜通透性 | 第47页 |
| ·封闭 | 第47-48页 |
| ·一抗孵育 | 第48页 |
| ·二抗孵育 | 第48页 |
| ·Hoechst染核 | 第48页 |
| ·封片 | 第48页 |
| ·激光共聚焦显微镜观察记录 | 第48页 |
| 9 蛋白质免疫共沉淀和串联亲和纯化 | 第48-50页 |
| ·细胞裂解 | 第48-49页 |
| ·免疫共沉淀 | 第49页 |
| ·SDS-PAGE | 第49页 |
| ·串联亲和纯化 | 第49-50页 |
| 10 凝胶电泳阻滞实验(EMSA)分析 | 第50-52页 |
| ·抽提核蛋白 | 第50页 |
| ·生物素标记探针 | 第50-51页 |
| ·PAGE电泳转膜 | 第51页 |
| ·杂交及显影 | 第51-52页 |
| ·溶液配制 | 第52页 |
| 11 生物素标记DNA沉淀实验 | 第52-53页 |
| ·抽提核蛋白(见EMSA) | 第52页 |
| ·链亲和素琼脂糖珠预处理 | 第52页 |
| ·生物素标记DNA沉淀步骤 | 第52-53页 |
| ·缓冲液配制 | 第53页 |
| 12 染色质免疫沉淀(ChIP) | 第53-56页 |
| ·细胞固定 | 第53页 |
| ·细胞核提取 | 第53页 |
| ·细胞核裂解与超声处理 | 第53-54页 |
| ·超声结果分析 | 第54页 |
| ·免疫沉淀 | 第54页 |
| ·DNA分离及纯化 | 第54-55页 |
| ·PCR反应 | 第55页 |
| ·ChIP实验中所用的各种溶液 | 第55-56页 |
| 13 染色质构象捕获技术(3C) | 第56-59页 |
| ·交联固定的细胞核制备 | 第56页 |
| ·细胞裂解与细胞核分离 | 第56页 |
| ·台盼蓝染色检测细胞裂解情况 | 第56-57页 |
| ·非特异结合蛋白洗脱与SDS中和 | 第57页 |
| ·细胞核保存 | 第57页 |
| ·细胞核内染色质DNA的限制性内切酶消化与鉴定 | 第57页 |
| ·细胞核限制性内切酶消化 | 第57页 |
| ·限制性内切酶消化效率鉴定 | 第57页 |
| ·交联固定的染色质复合物内DNA分子的连接 | 第57-58页 |
| ·细胞核裂解与SDS中和 | 第57-58页 |
| ·染色质复合物内DNA分子的连接 | 第58页 |
| ·连接产物DNA的制备与定量 | 第58-59页 |
| ·染色质复合物解交联 | 第58页 |
| ·DNA片段纯化、回收与定量 | 第58页 |
| ·连接产物DNA线性扩增范围确定 | 第58-59页 |
| 14 染色质免疫共沉淀与3C方法联合(ChIP-3C) | 第59-60页 |
| 实验结果 | 第60-91页 |
| 一、红系细胞中表达的核基质结合蛋白SATB2具有γ珠蛋白启动子MAR元件的结合能力 | 第60-64页 |
| 1 生物素标记DNA探针沉淀法检测到SATB2具有结合在γ珠蛋白启动子MAR元件的能力 | 第60-61页 |
| 2 SATB2在人胚胎胎儿期红系分化过程中持续表达并主要在小鼠发育早期表达 | 第61-64页 |
| 二、SATB2特异结合到~Gγ和~Aγ珠蛋白基因启动子MAR元件上 | 第64-72页 |
| 1 K562细胞中SATB2特异结合到~Gγ和~Aγ珠蛋白基因启动子上 | 第64-68页 |
| ·ChIp实验检测到SATB2在人γ珠蛋白基因启动子上结合 | 第64-66页 |
| ·测序和酶切法检测到SATB2在~Gγ启动子上的结合强于~Aγ启动子 | 第66-68页 |
| 2 EMSA实验中SATB2可以特异结合到~GY和~Aγ珠蛋白基因启动子的MAR元件上 | 第68-72页 |
| ·EMSA实验中SATB2可结合在野生型人γ珠蛋白基因启动子上 | 第68-70页 |
| ·EMSA实验中SATB2无法结合突变AT富含区的人γ珠蛋白基因启动子 | 第70-72页 |
| 三、SATB2在K562细胞和人原代红系分化细胞中激活人γ珠蛋白基因表达 | 第72-82页 |
| 1 SATB2对人γ珠蛋白基因启动子具有反式激活能力 | 第72-74页 |
| 2 K562细胞中SATB2上调人γ珠蛋白基因表达 | 第74-80页 |
| ·SATB2在K562细胞中上调人γ珠蛋白基因表达 | 第74-76页 |
| ·测序和酶切法检测到K562细胞中~Gγ的表达高于~Aγ珠蛋白 | 第76-78页 |
| ·SATB2促进人γ珠蛋白基因启动子组蛋白修饰和聚合酶Ⅱ募集 | 第78-80页 |
| 3 SATB2在人原代红系分化细胞中上调人γ珠蛋白基因表达 | 第80-82页 |
| 四、PCAF增强SATB2对人γ珠蛋白基因的激活作用 | 第82-88页 |
| 1 K562细胞中SATB2和PCAF相互作用 | 第82-83页 |
| 2 PCAF促进SATB2的反式激活能力 | 第83页 |
| 3 SATB2增加了PCAF在人γ珠蛋白基因启动子上的募集 | 第83-84页 |
| 4 串联亲和纯化法发现SATB2的相互作用蛋白SATB1等 | 第84-88页 |
| 五、SATB2促进人~Gγ与~Aγ珠蛋白基因间的空间靠近 | 第88-91页 |
| 1 SATB2介导人γ珠蛋白基因启动子间的空间靠近 | 第88-89页 |
| 2 SATB2具有分子间自我相互作用 | 第89-91页 |
| 讨论 | 第91-99页 |
| 一、核基质结合蛋白SATB1和SATB2参与基因转录调控 | 第91-92页 |
| 二、SATB2在红系细胞中表达并调控γ珠蛋白基因表达 | 第92-93页 |
| 1 SATB2在红系细胞中表达 | 第92页 |
| 2 SATB2直接激活γ珠蛋白基因表达 | 第92-93页 |
| 3 SATB2可募集辅因子PCAF参与其反式激活作用 | 第93页 |
| 三、SATB2介导珠蛋白基因簇内~Gγ和~Aγ珠蛋白基因的空间靠近 | 第93-94页 |
| 1 珠蛋白基因簇活化时具有活性染色质中心结构 | 第93-94页 |
| 2 SATB2介导活性染色质中心内MAR元件的靠近 | 第94页 |
| 3 SATB2介导MAR元件的靠近可能是基因表达上调的重要因素 | 第94页 |
| 四、SATB1和SATB2对染色质高级结构组织中的协同分工 | 第94-96页 |
| 1 SATB1和SATB2在Xist RNA的沉默功能和在ES细胞分化过程中的作用 | 第94-95页 |
| 2 SATB1和SATB2在珠蛋白基因调控中具有协同与分工 | 第95页 |
| 3 SATB1和SATB2可能形成同源/异源多聚物参与基因表达调控和染色质空间结构组织 | 第95-96页 |
| 五、“活性~(G/A)γ-MAR靠近”模型 | 第96-98页 |
| 六、本研究的不足与展望 | 第98-99页 |
| 小结 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-106页 |
| 文献综述 | 第106-112页 |
| 参考文献 | 第110-112页 |
| 英文名词及缩写 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 个人简历 | 第114-115页 |
