| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 前言 | 第15-24页 |
| 1. 琼胶(agar) | 第15-16页 |
| 2. 琼胶酶(agarase) | 第16-24页 |
| ·琼胶酶的分类 | 第16-17页 |
| ·根据作用方式分类 | 第16页 |
| ·琼胶酶的糖苷水解酶家族归属 | 第16-17页 |
| ·琼胶酶的来源和性质 | 第17-19页 |
| ·琼胶酶的来源 | 第17页 |
| ·天然β-琼胶酶及其酶学性质 | 第17-18页 |
| ·天然α-琼胶酶及其酶学性质 | 第18-19页 |
| ·琼胶酶编码基因克隆及重组酶性质 | 第19-20页 |
| ·琼胶酶的晶体结构 | 第20-21页 |
| ·琼胶酶的应用 | 第21-24页 |
| ·分子生物学方面的应用 | 第21-22页 |
| ·制备琼胶寡糖 | 第22页 |
| ·酶解海藻的工具 | 第22-24页 |
| 第一章 产琼胶酶菌株 Thalassomonas sp. LD5 的筛选及鉴定 | 第24-33页 |
| 1. 实验材料 | 第24-25页 |
| ·试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第24页 |
| ·仪器 | 第24-25页 |
| ·菌种、质粒 | 第25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| 2. 实验方法与步骤 | 第25-27页 |
| ·菌种的初筛 | 第25页 |
| ·菌种的复筛——降解产物分析 | 第25-26页 |
| ·菌种鉴定 | 第26-27页 |
| ·形态观察 | 第26页 |
| ·细菌基因组 DNA 的提取 | 第26页 |
| ·感受态细胞 E.coli DH5α的制备 | 第26页 |
| ·16S rDNA 的克隆与序列测定 | 第26-27页 |
| ·质粒 DNA 的提取制备 | 第27页 |
| ·数据分析 | 第27页 |
| 3. 结果与分析 | 第27-32页 |
| ·产琼胶酶菌株的降解产物分析 | 第27-29页 |
| ·LD5 形态观察 | 第29页 |
| ·16S rDNA 基因的克隆 | 第29-30页 |
| ·16S rDNA 基因序列分析和系统发育树的构建 | 第30-32页 |
| 4. 小结与讨论 | 第32-33页 |
| 第二章 琼胶酶的分离纯化及其酶学性质研究 | 第33-50页 |
| 1. 琼胶酶的分离纯化 | 第33-39页 |
| ·实验材料 | 第33-34页 |
| ·仪器 | 第33页 |
| ·试剂 | 第33页 |
| ·菌株 | 第33-34页 |
| ·培养基 | 第34页 |
| ·缓冲液 | 第34页 |
| ·实验方法 | 第34-36页 |
| ·酶活力测定方法 | 第34页 |
| ·培养条件的优化 | 第34页 |
| ·粗酶液的制备 | 第34页 |
| ·离子交换层析 | 第34-35页 |
| ·疏水层析 | 第35页 |
| ·凝胶过滤层析 | 第35页 |
| ·SDS-PAGE | 第35-36页 |
| ·实验结果 | 第36-39页 |
| ·D-半乳糖标准曲线（DNS 法测定） | 第36页 |
| ·培养条件的优化 | 第36-37页 |
| ·离子交换层析 | 第37页 |
| ·疏水层析 | 第37-38页 |
| ·凝胶过滤层析 | 第38-39页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第39页 |
| 2. 琼胶酶的酶学性质研究 | 第39-48页 |
| ·实验方法 | 第39-41页 |
| ·底物特异性实验 | 第39页 |
| ·酶的最适反应温度 | 第39页 |
| ·温度对酶活稳定性的影响 | 第39-40页 |
| ·酶的最适反应 pH | 第40页 |
| ·pH 对酶活稳定性的影响 | 第40页 |
| ·金属离子、SDS 及 EDTA 对酶活性的影响 | 第40页 |
| ·酶的米氏常数 Km与 Vmax的确定 | 第40-41页 |
| ·降解产物分析 | 第41页 |
| ·实验结果 | 第41-48页 |
| ·酶的底物特异性 | 第41-42页 |
| ·酶的最适反应温度 | 第42页 |
| ·酶的温度稳定性 | 第42-43页 |
| ·酶的最适反应 pH | 第43页 |
| ·酶的 pH 稳定性 | 第43-44页 |
| ·金属离子、SDS 及 EDTA 对酶活性的影响 | 第44-46页 |
| ·米氏常数 Km与 Vmax的计算 | 第46页 |
| ·降解产物分析 | 第46-48页 |
| 3. 小结与讨论 | 第48-50页 |
| 第三章 LD5 琼胶酶基因 agaD 的克隆与序列分析 | 第50-64页 |
| 1. 琼胶酶基因 agaD 的克隆 | 第50-59页 |
| ·实验材料 | 第50-51页 |
| ·仪器 | 第50-51页 |
| ·试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第51页 |
| ·菌株与质粒 | 第51页 |
| ·培养基 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-56页 |
| ·Thalassomonas sp. LD5 基因组的提取 | 第51页 |
| ·引物合成与 DNA 测序 | 第51页 |
| ·兼并 PCR(Degenarate PCR)扩增目的片段 | 第51-52页 |
| ·SiteFinding PCR 扩增侧翼序列 | 第52-55页 |
| ·目的 DNA 分子的克隆 | 第55-56页 |
| ·筛选与测序 | 第56页 |
| ·实验结果 | 第56-59页 |
| ·兼并 PCR 结果 | 第56-58页 |
| ·Site-Finding PCR 结果 | 第58-59页 |
| 2. 琼胶酶基因 agaD 的序列分析 | 第59-63页 |
| ·序列分析方法 | 第59页 |
| ·序列分析的结果 | 第59-63页 |
| ·agaD 基因序列分析 | 第59页 |
| ·BLASTp 序列相似性搜索 | 第59-61页 |
| ·RPS-BLAST 保守域(Conserved Domain)搜索 | 第61页 |
| ·琼胶酶 AgaD 的信号肽(Signal peptide)预测 | 第61-62页 |
| ·琼胶酶 AgaD 的结构预测 | 第62-63页 |
| 3．小结与讨论 | 第63-64页 |
| 第四章 琼胶酶 agaD 基因的重组表达、密码子优化与降解产物分析 | 第64-92页 |
| 1. 琼胶酶 agaD 的重组表达与降解产物分析 | 第64-74页 |
| ·材料与仪器 | 第64-65页 |
| ·实验材料 | 第64页 |
| ·实验仪器 | 第64-65页 |
| ·实验方法 | 第65-69页 |
| ·设计引物 | 第65页 |
| ·PCR 扩增 agaD | 第65-66页 |
| ·PCR 产物的纯化与酶切 | 第66-67页 |
| ·pET-24a(+)载体质粒的制备 | 第67页 |
| ·建立重组表达载体 | 第67-68页 |
| ·pET-24a(+)-agaD 基因的表达 | 第68页 |
| ·表达产物的检测 | 第68页 |
| ·重组酶降解产物分析 | 第68-69页 |
| ·实验结果 | 第69-74页 |
| ·agaD 基因的 PCR 扩增 | 第69页 |
| ·pET-24a(+)载体质粒的制备 | 第69页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第69-70页 |
| ·DNA 测序 | 第70页 |
| ·agaD 基因的表达及表达产物的检测 | 第70-72页 |
| ·重组酶降解产物分析 | 第72-74页 |
| 2. agaD 催化区域的重组表达 | 第74-80页 |
| ·实验方法 | 第74-78页 |
| ·选择表达载体 | 第74-75页 |
| ·设计引物 | 第75页 |
| ·PCR 扩增 agaD 催化区域 | 第75-76页 |
| ·PCR 产物的纯化与酶切 | 第76-77页 |
| ·pET-24a(+)、pET44b(+)、pBAD/HisA 载体质粒的制备 | 第77页 |
| ·建立重组表达载体 | 第77页 |
| ·agaD 基因催化区域的表达 | 第77-78页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测表达产物 | 第78页 |
| ·实验结果 | 第78-80页 |
| ·agaD 基因催化区域的 PCR 扩增与纯化 | 第78页 |
| ·pET-24a(+)、pET44b(+)、pBAD/HisA 载体质粒的制备 | 第78-79页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第79页 |
| ·agaD 基因催化区域的表达及表达产物的 SDS-PAGE 检测 | 第79-80页 |
| 3. agaD 基因的密码子优化 | 第80-81页 |
| 4. 密码子优化后 agaD 催化区的重组表达 | 第81-90页 |
| ·实验方法 | 第81-86页 |
| ·Long/Mid/Short 片段的制备 | 第82-83页 |
| ·PCR 产物的纯化与酶切 | 第83页 |
| ·pET-22b(+)载体质粒的制备 | 第83-84页 |
| ·pET-22b(+)-Long/Mid/Short 载体的制备 | 第84-85页 |
| ·合成的基因片段的酶切与纯化 | 第85-86页 |
| ·重组表达载体的建立 | 第86页 |
| ·突变体 pET-22b(+)-Long/Mid/Short-1971 的表达 | 第86页 |
| ·表达产物的检测 | 第86页 |
| ·实验结果 | 第86-90页 |
| ·Long/Mid/Short 片段的 PCR 扩增 | 第86-87页 |
| ·pET-22b(+)载体质粒的制备 | 第87-88页 |
| ·载体的构建 | 第88页 |
| ·突变体表达产物的检测 | 第88-90页 |
| 5. 小结与讨论 | 第90-92页 |
| 总结与展望 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-99页 |
| 附录 1 常用培养基的配制方法 | 第99-100页 |
| 附录 2 常用试剂、溶液的配制方法 | 第100-104页 |
| 附录 3 常用分子生物学实验方法 | 第104-108页 |
| 附录 4 缩略词汇总 | 第108-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 个人简历 | 第110页 |
| 发表的学术论文 | 第110页 |
